U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 to genetycznie zmodyfikowana linia komórek ludzkiego osteosarcoma pochodząca z macierzystego tła U2OS, w której endogenny locus NUP133 został zmodyfikowany za pomocą edycji genomu za pomocą CRISPR/Cas9 w celu zakodowania tagu C-terminalnego SNAPf. NUP133 jest podstawowym składnikiem kompleksu Y (kompleksu NUP107-160), podkompleksu strukturalnego niezbędnego do montażu i utrzymania kompleksu porów jądrowych (NPC). Dzięki wprowadzeniu sekwencji kodującej SNAPf w ramce endogennego locus, białko fuzyjne jest wyrażane pod natywną kontrolą regulacyjną, zachowując fizjologiczne poziomy ekspresji i lokalizację subkomórkową.

Tag SNAPf jest szybko znakującym wariantem tagu SNAP, inżynieryjnej O6-alkiloguaniny-DNA alkiltransferazy, która reaguje kowalencyjnie z substratami sprzężonymi z benzyloguaniną. Umożliwia to wysoce specyficzne i wszechstronne znakowanie fluorescencyjne Nup133 w żywych lub utrwalonych komórkach przy użyciu substratów SNAP przenikających lub nieprzenikających przez komórki. W komórkach U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 białko fuzyjne lokalizuje się w otoczce jądrowej w postaci charakterystycznych dla kompleksów porów jądrowych punktów. Ponieważ znakowanie odbywa się w endogenicznym locus, stechiometria i architektura NPC są minimalnie zaburzone, co sprawia, że model ten nadaje się do ilościowej mikroskopii superrozdzielczej, śledzenia pojedynczych cząsteczek oraz analiz kinetycznych montażu i obrotu NPC.

Ta linia komórkowa stanowi solidną platformę do badania transportu jądrowego, dynamiki transportu jądrowo-cytoplazmatycznego, biogenezy NPC podczas interfazy i ponownego montażu jądra po mitozy oraz organizacji strukturalnej kompleksu Y w ramach szkieletu porów. Tło U2OS oferuje płaską morfologię i duże jądra, ułatwiając obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Komórki U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 są szczególnie dobrze przystosowane do eksperymentów znakowania metodą pulse-chase, korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej oraz wielobarwnego obrazowania w połączeniu z dodatkowymi endogennie znakowanymi nukleoporinami lub czynnikami transportowymi.

37°C, 5%_CO2, nawilżona atmosfera.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

Zanieczyszczenie mykoplazmą jest wykluczane przy użyciu zarówno testów opartych na PCR, jak i metod wykrywania mykoplazmy opartych na luminescencji.

Aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia bakteriami, grzybami lub drożdżami, hodowle komórkowe są poddawane codziennym kontrolom wizualnym.

W celu długotrwałego przechowywania należy umieścić fiolki w ciekłym azocie w fazie lotnej w temperaturze od -150 do -196 °C. Przechowywanie w temperaturze -80 °C jest dopuszczalne tylko jako krótki etap przejściowy przed przeniesieniem do ciekłego azotu.

Linie komórkowe poddane kriokonserwacji są wysyłane w suchym lodzie w zatwierdzonych, izolowanych opakowaniach z wystarczającą ilością czynnika chłodniczego, aby utrzymać temperaturę około -78°C przez cały czas transportu. Po otrzymaniu przesyłki należy natychmiast sprawdzić pojemnik i bezzwłocznie przenieść fiolki do odpowiedniego miejsca przechowywania.

W Cytion gwarantujemy jakość i żywotność naszych produktów. Gwarantujemy, że nasze komórki będą żywotne na początku hodowli przez 60 dni po wysyłce z naszych zakładów. Zapewniamy, że wszystkie materiały są zgodne ze specyfikacjami opisanymi w certyfikacie analizy i/lub karcie produktu

Szczegółowe informacje można znaleźć w naszej <a href=""/Who-we-are/Warranty/"" hreflang=""x-default"">Oświadczeniu gwarancyjnym