U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 es una línea celular de osteosarcoma humano modificada genéticamente derivada del fondo parental U2OS en la que se ha modificado el locus NUP133 endógeno mediante la edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9 para codificar una etiqueta SNAPf C-terminal. NUP133 es un componente central del complejo Y (complejo NUP107-160), un subcomplejo estructural esencial para el ensamblaje y mantenimiento del complejo de poros nucleares (NPC). Al introducir la secuencia codificante SNAPf en el locus endógeno, la proteína de fusión se expresa bajo control regulador nativo, conservando los niveles de expresión fisiológicos y la localización subcelular.

La etiqueta SNAPf es una variante de etiquetado rápido de la etiqueta SNAP, una O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa modificada genéticamente que reacciona covalentemente con sustratos conjugados con bencilguanina. Esto permite un etiquetado fluorescente altamente específico y versátil de Nup133 en células vivas o fijadas utilizando sustratos SNAP permeables o impermeables a las células. En las células U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133, la proteína de fusión se localiza en la envoltura nuclear con un patrón punteado característico de los complejos de poros nucleares. Dado que el etiquetado se produce en el locus endógeno, la estequiometría y la arquitectura de los NPC se ven mínimamente perturbadas, lo que hace que este modelo sea adecuado para la microscopía cuantitativa de superresolución, el seguimiento de moléculas individuales y los análisis cinéticos del ensamblaje y el recambio de los NPC.

Esta línea celular proporciona una plataforma sólida para estudiar el transporte nuclear, la dinámica del tráfico nucleocitoplasmático, la biogénesis de los NPC durante la interfase y el reensamblaje nuclear posmitótico, y la organización estructural del complejo Y dentro del andamio del poro. El fondo U2OS ofrece una morfología plana y núcleos grandes, lo que facilita la obtención de imágenes de alta resolución. Las células U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 son especialmente adecuadas para experimentos de marcaje por pulso-persecución, microscopía óptica y electrónica correlativa y técnicas de imagen multicolor en combinación con nucleoporinas o factores de transporte marcados endógenamente adicionales.

37°C, 5%_CO2, atmósfera humidificada.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

La contaminación por micoplasma se excluye utilizando tanto ensayos basados en la PCR como métodos de detección de micoplasma basados en la luminiscencia.

Para garantizar la ausencia de contaminación bacteriana, fúngica o por levaduras, los cultivos celulares se someten a inspecciones visuales diarias.

Para la conservación a largo plazo, colocar los viales en nitrógeno líquido en fase vapor a una temperatura aproximada de -150 a -196 °C. El almacenamiento a -80 °C sólo es aceptable como breve paso intermedio antes de la transferencia al nitrógeno líquido.

Las líneas celulares crioconservadas se envían en hielo seco en envases validados y aislados con suficiente refrigerante para mantener aproximadamente -78 °C durante el tránsito. A la recepción, inspeccione el envase inmediatamente y transfiera los viales sin demora al almacenamiento adecuado.

En Cytion, respaldamos la calidad y viabilidad de nuestros productos. Garantizamos que nuestras células serán viables al inicio del cultivo durante los 60 días posteriores al envío desde nuestras instalaciones. Aseguramos que todos los materiales se ajustan a las especificaciones descritas en el Certificado de Análisis y/o Hoja de Producto

Para más información, consulte nuestra <a href=""/Quiénes somos/Garantía/"" hreflang=""x-default"">Declaración de garantía