U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 ist eine gentechnisch veränderte humane Osteosarkom-Zelllinie, die aus dem parentalen U2OS-Hintergrund stammt, in dem der endogene NUP133-Locus mittels CRISPR/Cas9-vermittelter Genom-Editierung modifiziert wurde, um ein C-terminales SNAPf-Tag zu kodieren. NUP133 ist eine Kernkomponente des Y-Komplexes (NUP107-160-Komplex), einem strukturellen Subkomplex, der für den Aufbau und die Aufrechterhaltung des Kernporenkomplexes (NPC) unerlässlich ist. Durch die Einführung der SNAPf-Kodierungssequenz im In-Frame am endogenen Locus wird das Fusionsprotein unter nativer regulatorischer Kontrolle exprimiert, wodurch die physiologischen Expressionsniveaus und die subzelluläre Lokalisierung erhalten bleiben.

Das SNAPf-Tag ist eine schnell markierende Variante des SNAP-Tags, einer künstlich hergestellten O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase, die kovalent mit Benzylguanin-konjugierten Substraten reagiert. Dies ermöglicht eine hochspezifische und vielseitige Fluoreszenzmarkierung von Nup133 in lebenden oder fixierten Zellen unter Verwendung von zellpermeablen oder impermeablen SNAP-Substraten. In U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133-Zellen lokalisiert sich das Fusionsprotein in einem für Kernporenkomplexe charakteristischen punktförmigen Muster an der Kernhülle. Da die Markierung am endogenen Locus erfolgt, werden die Stöchiometrie und Architektur der NPC nur minimal gestört, sodass sich dieses Modell für quantitative Superauflösungsmikroskopie, Einzelmolekülverfolgung und kinetische Analysen des NPC-Aufbaus und -Umsatzes eignet.

Diese Zelllinie bietet eine robuste Plattform für die Untersuchung des Kerntransports, der Dynamik des nukleozytoplasmatischen Transports, der NPC-Biogenese während der Interphase und des postmitotischen Kernumbaus sowie der strukturellen Organisation des Y-Komplexes innerhalb des Porengerüsts. Der U2OS-Hintergrund bietet eine flache Morphologie und große Kerne, was eine hochauflösende Bildgebung erleichtert. U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133-Zellen eignen sich besonders gut für Pulse-Chase-Markierungsexperimente, korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie sowie Mehrfarben-Bildgebungsverfahren in Kombination mit zusätzlichen endogen markierten Nukleoporinen oder Transportfaktoren.

37°C, 5%_CO2, befeuchtete Atmosphäre.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

Eine Kontamination mit Mykoplasmen wird sowohl durch PCR-basierte Assays als auch durch lumineszenzbasierte Mykoplasmen-Nachweisverfahren ausgeschlossen.

Um sicherzustellen, dass keine Kontamination mit Bakterien, Pilzen oder Hefen vorliegt, werden die Zellkulturen täglich visuell überprüft.

Zur Langzeitkonservierung werden die Fläschchen in flüssigem Stickstoff bei etwa -150 bis -196 °C gelagert. Eine Lagerung bei -80 °C ist nur als kurzer Zwischenschritt vor der Überführung in flüssigen Stickstoff akzeptabel.

Kryokonservierte Zelllinien werden auf Trockeneis in einer validierten, isolierten Verpackung mit ausreichend Kühlmittel versandt, um während des gesamten Transports eine Temperatur von etwa -78 °C aufrechtzuerhalten. Prüfen Sie den Behälter bei Erhalt sofort und bringen Sie die Fläschchen unverzüglich in ein geeignetes Lager.

Bei Cytion stehen wir hinter der Qualität und Lebensfähigkeit unserer Produkte. Wir garantieren, dass unsere Zellen zu Beginn der Kultur für 60 Tage nach dem Versand aus unseren Einrichtungen lebensfähig sind. Wir versichern, dass alle Materialien mit den im Analysezertifikat und/oder Produktblatt beschriebenen Spezifikationen übereinstimmen

Ausführliche Informationen finden Sie in unserer <a href=""/Who-we-are/Warranty/"" hreflang=""x-default"">Garantieerklärung