U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 est une lignée cellulaire humaine d'ostéosarcome génétiquement modifiée dérivée de la lignée parentale U2OS, dans laquelle le locus NUP133 endogène a été modifié à l'aide de l'édition génomique CRISPR/Cas9 afin de coder une étiquette SNAPf C-terminale. NUP133 est un composant central du complexe Y (complexe NUP107-160), un sous-complexe structurel essentiel à l'assemblage et au maintien du complexe des pores nucléaires (NPC). En introduisant la séquence codante SNAPf dans le cadre du locus endogène, la protéine de fusion est exprimée sous contrôle régulateur natif, préservant ainsi les niveaux d'expression physiologiques et la localisation subcellulaire.

Le marqueur SNAPf est une variante à marquage rapide du marqueur SNAP, une O6-alkylguanine-ADN alkyltransférase modifiée qui réagit de manière covalente avec des substrats conjugués à la benzylguanine. Cela permet un marquage fluorescent hautement spécifique et polyvalent de Nup133 dans des cellules vivantes ou fixées à l'aide de substrats SNAP perméables ou imperméables aux cellules. Dans les cellules U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133, la protéine de fusion se localise dans l'enveloppe nucléaire selon un motif ponctuel caractéristique des complexes poreux nucléaires. Comme le marquage se produit au niveau du locus endogène, la stœchiométrie et l'architecture des NPC sont très peu perturbées, ce qui rend ce modèle adapté à la microscopie quantitative à super-résolution, au suivi de molécules individuelles et aux analyses cinétiques de l'assemblage et du renouvellement des NPC.

Cette lignée cellulaire constitue une plateforme robuste pour l'étude du transport nucléaire, de la dynamique du trafic nucléocytoplasmique, de la biogenèse des NPC pendant l'interphase et le réassemblage nucléaire post-mitotique, ainsi que de l'organisation structurelle du complexe Y au sein de la structure poreuse. Le fond U2OS offre une morphologie plate et de grands noyaux, facilitant l'imagerie haute résolution. Les cellules U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 sont particulièrement bien adaptées aux expériences de marquage par impulsions-poursuite, à la microscopie optique et électronique corrélative et aux approches d'imagerie multicolore en combinaison avec des nucléoporines ou des facteurs de transport supplémentaires marqués de manière endogène.

37°C, 5%_CO2, atmosphère humidifiée.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

La contamination par les mycoplasmes est exclue à l'aide de tests basés sur la PCR et de méthodes de détection des mycoplasmes basées sur la luminescence.

Pour s'assurer de l'absence de contamination bactérienne, fongique ou levurienne, les cultures cellulaires font l'objet d'inspections visuelles quotidiennes.

Pour une conservation à long terme, placer les flacons dans de l'azote liquide en phase vapeur à une température comprise entre -150 et -196 °C environ. Le stockage à -80 °C n'est acceptable qu'en tant qu'étape intermédiaire de courte durée avant le transfert dans l'azote liquide.

Les lignées cellulaires cryoconservées sont expédiées sur glace sèche dans des emballages isolés et validés, avec suffisamment de réfrigérant pour maintenir une température d'environ -78 °C tout au long du transport. À la réception, inspecter immédiatement le conteneur et transférer sans délai les flacons dans un lieu de stockage approprié.

Chez Cytion, nous nous portons garants de la qualité et de la viabilité de nos produits. Nous garantissons que nos cellules seront viables au début de la culture pendant 60 jours après l'expédition de nos installations. Nous assurons que tous les matériaux sont conformes aux spécifications décrites dans le certificat d'analyse et/ou la fiche produit

Pour plus de détails, veuillez consulter notre <a href=""/Who-we-are/Warranty/"" hreflang=""x-default""> Déclaration de garantie