U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 est une lignée cellulaire d’ostéosarcome humain génétiquement modifiée, dérivée de la lignée parentale U2OS, dans laquelle le locus endogène NUP133 a été modifié à l’aide de l’édition génomique par CRISPR/Cas9 afin de coder pour une étiquette SNAPf C-terminale. NUP133 est un composant essentiel du complexe Y (complexe NUP107-160), un sous-complexe structurel indispensable à l’assemblage et au maintien du complexe des pores nucléaires (NPC). En introduisant la séquence codante de SNAPf en phase de lecture au niveau du locus endogène, la protéine de fusion est exprimée sous le contrôle régulateur natif, ce qui préserve les niveaux d’expression physiologiques et la localisation subcellulaire.

Le marqueur SNAPf est une variante à marquage rapide du marqueur SNAP, une O6-alkylguanine-ADN-alkyltransférase modifiée qui réagit de manière covalente avec des substrats conjugués à la benzylguanine. Cela permet un marquage fluorescent hautement spécifique et polyvalent de la protéine Nup133 dans des cellules vivantes ou fixées, à l’aide de substrats SNAP perméables ou imperméables aux cellules. Dans les cellules U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133, la protéine de fusion se localise sur l’enveloppe nucléaire selon un motif ponctuel caractéristique des complexes de pores nucléaires. Comme le marquage se produit au niveau du locus endogène, la stœchiométrie et l’architecture des NPC ne sont que très peu perturbées, ce qui rend ce modèle adapté à la microscopie quantitative à super-résolution, au suivi de molécules individuelles et aux analyses cinétiques de l’assemblage et du renouvellement des NPC.

Cette lignée cellulaire constitue une plateforme robuste pour l’étude du transport nucléaire, de la dynamique du trafic nucléocytoplasmique, de la biogenèse des NPC pendant l’interphase et du réassemblage nucléaire post-mitotique, ainsi que de l’organisation structurelle du complexe Y au sein de la charpente des pores. La lignée U2OS présente une morphologie plate et de grands noyaux, ce qui facilite l’imagerie à haute résolution. Les cellules U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 sont particulièrement bien adaptées aux expériences de marquage par impulsion-poursuite, à la microscopie corrélative optique et électronique, ainsi qu’aux approches d’imagerie multicolore en combinaison avec d’autres nucléoporines ou facteurs de transport marqués de manière endogène.

37 °C, 5 % _de CO_₂, atmosphère humidifiée.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

La contamination par les mycoplasmes est exclue à l'aide de tests basés sur la PCR et de méthodes de détection des mycoplasmes par luminescence.

Afin de s’assurer qu’il n’y a aucune contamination bactérienne, fongique ou par des levures, les cultures cellulaires font l’objet d’inspections visuelles quotidiennes.

Pour une conservation à long terme, placez les flacons dans de l’azote liquide en phase vapeur à une température comprise entre environ −150 et −196 °C. L’entreposage à −80 °C n’est acceptable qu’à titre d’étape intermédiaire de courte durée avant le transfert dans l’azote liquide.

Les lignées cellulaires cryoconservées sont expédiées dans de la glace sèche, dans un emballage isotherme validé contenant suffisamment de réfrigérant pour maintenir une température d’environ −78 °C pendant tout le transport. À la réception, inspectez immédiatement le conteneur et transférez sans délai les flacons dans un lieu de stockage approprié.

Chez Cytion, nous garantissons la qualité et la viabilité de nos produits. Nous garantissons que nos cellules seront viables au début de la culture pendant 60 jours à compter de leur expédition depuis nos installations. Nous assurons que tous les matériaux sont conformes aux spécifications décrites dans le certificat d’analyse et/ou la fiche technique du produit.

Pour plus de détails, veuillez consulter notre déclaration de garantie.