U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 es una línea celular de osteosarcoma humano modificada genéticamente, derivada de la línea parental U2OS, en la que el locus endógeno de NUP133 ha sido modificado mediante edición genómica mediada por CRISPR/Cas9 para codificar una etiqueta SNAPf en el extremo C-terminal. NUP133 es un componente central del complejo Y (complejo NUP107-160), un subcomplejo estructural esencial para el ensamblaje y mantenimiento del complejo de poros nucleares (NPC). Al introducir la secuencia codificante de SNAPf en marco de lectura en el locus endógeno, la proteína de fusión se expresa bajo control regulatorio nativo, conservando los niveles de expresión fisiológicos y la localización subcelular.

La etiqueta SNAPf es una variante de marcaje rápido de la etiqueta SNAP, una O6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa modificada genéticamente que reacciona covalentemente con sustratos conjugados con bencilguanina. Esto permite un marcaje fluorescente altamente específico y versátil de Nup133 en células vivas o fijadas utilizando sustratos SNAP permeables o impermeables a la membrana celular. En las células U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133, la proteína de fusión se localiza en la envoltura nuclear con un patrón punteado característico de los complejos de poros nucleares. Dado que el marcaje ocurre en el locus endógeno, la estequiometría y la arquitectura de los complejos de poros nucleares (NPC) se ven mínimamente alteradas, lo que hace que este modelo sea adecuado para la microscopía cuantitativa de superresolución, el seguimiento de moléculas individuales y los análisis cinéticos del ensamblaje y la renovación de los NPC.

Esta línea celular proporciona una plataforma robusta para estudiar el transporte nuclear, la dinámica del tráfico nucleocitoplasmático, la biogénesis de los NPC durante la interfase y el reensamblaje nuclear posmitótico, así como la organización estructural del complejo Y dentro del andamio de los poros. El fondo U2OS ofrece una morfología plana y núcleos grandes, lo que facilita la obtención de imágenes de alta resolución. Las células U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 son particularmente adecuadas para experimentos de marcaje de pulso-persecución, microscopía correlativa de luz y electrónica, y técnicas de imágenes multicolores en combinación con nucleoporinas o factores de transporte adicionales marcados de forma endógena.

37 °C, 5 % de CO₂, atmósfera humidificada.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

Se descarta la contaminación por micoplasmas mediante ensayos basados en PCR y métodos de detección de micoplasmas basados en luminiscencia.

Para garantizar que no haya contaminación bacteriana, fúngica o por levaduras, los cultivos celulares se someten a inspecciones visuales diarias.

Para la conservación a largo plazo, coloque los viales en nitrógeno líquido en fase de vapor a una temperatura de entre −150 y −196 °C, aproximadamente. El almacenamiento a −80 °C solo es aceptable como un paso intermedio breve antes de transferirlos al nitrógeno líquido.

Las líneas celulares criopreservadas se envían en hielo seco, en un embalaje aislante validado que contiene suficiente refrigerante para mantener una temperatura de aproximadamente −78 °C durante todo el transporte. Al recibir el envío, revise el contenedor de inmediato y traslade los viales sin demora al lugar de almacenamiento adecuado.

En Cytion, respaldamos la calidad y la viabilidad de nuestros productos. Garantizamos que nuestras células serán viables al inicio del cultivo durante 60 días a partir de la fecha de envío desde nuestras instalaciones. Aseguramos que todos los materiales cumplen con las especificaciones descritas en el Certificado de Análisis y/o la Ficha del Producto.

Para obtener más detalles, consulte nuestra Declaración de garantía.