U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 je geneticky modifikovaná ľudská osteosarkómová bunková línia odvodená z rodičovského pozadia U2OS, v ktorej bol endogénny lokus NUP133 modifikovaný pomocou editovania genómu sprostredkovaného CRISPR/Cas9 tak, aby kódoval C-terminálnu značku SNAPf. NUP133 je základnou zložkou Y-komplexu (komplex NUP107-160), štrukturálneho subkomplexu, ktorý je nevyhnutný pre zostavenie a udržanie komplexu jadrových pórov (NPC). Zavedením kódujúcej sekvencie SNAPf do endogénneho lokusu sa fúzny proteín exprimuje pod pôvodnou regulačnou kontrolou, čím sa zachovávajú fyziologické hladiny expresie a subcelulárna lokalizácia.

Značka SNAPf je variantom rýchleho značenia SNAP-značky, umelo vytvorenej O6-alkylguanín-DNA alkyltransferázy, ktorá kovalentne reaguje s benzylguanínom konjugovanými substrátmi. To umožňuje vysoko špecifické a univerzálne fluorescenčné značenie Nup133 v živých alebo fixovaných bunkách pomocou bunkovo priepustných alebo nepriepustných SNAP substrátov. V bunkách U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 sa fúzny proteín lokalizuje do jadrovej membrány v bodkovitom vzore charakteristickom pre jadrové pórové komplexy. Keďže značkovanie prebieha na endogénnom mieste, stechiometria a architektúra NPC sú minimálne narušené, čo robí tento model vhodným pre kvantitatívnu mikroskopiu s vysokým rozlíšením, sledovanie jednotlivých molekúl a kinetické analýzy zostavovania a obratu NPC.

Táto bunková línia poskytuje robustnú platformu na štúdium jadrového transportu, dynamiky nukleocytoplazmatického transportu, biogenézy NPC počas interfázy a postmitotickej jadrovej reorganizácie a štrukturálnej organizácie Y-komplexu v rámci pórovitej kostry. Pozadie U2OS ponúka plochú morfológiu a veľké jadrá, čo uľahčuje zobrazovanie s vysokým rozlíšením. Bunky U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 sú obzvlášť vhodné pre experimenty s pulzno-chase značením, korelačnú svetelnú a elektrónovú mikroskopiu a multicolorové zobrazovacie prístupy v kombinácii s ďalšími endogénne značenými nukleoporínmi alebo transportnými faktormi.

37 °C, 5 %_CO2, zvlhčená atmosféra.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

Kontaminácia mykoplazmami sa vylučuje pomocou testov založených na PCR a metód detekcie mykoplaziem založených na luminiscencii.

Aby sa zabezpečilo, že nedošlo ku kontaminácii baktériami, hubami alebo kvasinkami, bunkové kultúry sa denne vizuálne kontrolujú.

Na dlhodobé uchovávanie umiestnite injekčné liekovky do kvapalnej fázy dusíka v pare pri teplote približne -150 až -196 °C. Skladovanie pri teplote -80 °C je prijateľné len ako krátky prechodný krok pred presunom do tekutého dusíka.

Kryokonzervované bunkové línie sa prepravujú na suchom ľade v overených, izolovaných obaloch s dostatočným množstvom chladiva na udržanie teploty približne -78 °C počas celej prepravy. Po prijatí ihneď skontrolujte obal a bezodkladne premiestnite injekčné liekovky do vhodného skladu.

V spoločnosti Cytion si stojíme za kvalitou a životaschopnosťou našich produktov. Garantujeme, že naše bunky budú životaschopné na začiatku kultivácie počas 60 dní po odoslaní z našich zariadení. Zaručujeme, že všetky materiály zodpovedajú špecifikáciám opísaným v certifikáte analýzy a/alebo v produktovom liste

Úplné informácie nájdete v našom <a href=""/Kto sme/záruka/"" hreflang=""x-default"">Vyhlásení o záruke