U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 è una linea cellulare di osteosarcoma umano geneticamente modificata derivata dal background parentale U2OS in cui il locus NUP133 endogeno è stato modificato utilizzando l'editing genomico mediato da CRISPR/Cas9 per codificare un tag SNAPf C-terminale. NUP133 è un componente fondamentale del complesso Y (complesso NUP107-160), un sottocomplesso strutturale essenziale per l'assemblaggio e il mantenimento del complesso dei pori nucleari (NPC). Introducendo la sequenza codificante SNAPf in-frame nel locus endogeno, la proteina di fusione viene espressa sotto il controllo regolatorio nativo, preservando i livelli di espressione fisiologica e la localizzazione subcellulare.

Il tag SNAPf è una variante a marcatura rapida del tag SNAP, un O6-alchilguanina-DNA alchiltransferasi ingegnerizzato che reagisce in modo covalente con substrati coniugati con benzilguanina. Ciò consente una marcatura fluorescente altamente specifica e versatile di Nup133 in cellule vive o fissate utilizzando substrati SNAP permeabili o impermeabili alle cellule. Nelle cellule U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133, la proteina di fusione si localizza nell'involucro nucleare con un pattern puntiforme caratteristico dei complessi dei pori nucleari. Poiché l'etichettatura avviene nel locus endogeno, la stechiometria e l'architettura dell'NPC sono minimamente perturbate, rendendo questo modello adatto alla microscopia quantitativa a super risoluzione, al tracciamento di singole molecole e alle analisi cinetiche dell'assemblaggio e del turnover dell'NPC.

Questa linea cellulare fornisce una solida piattaforma per lo studio del trasporto nucleare, delle dinamiche del traffico nucleocitoplasmatico, della biogenesi degli NPC durante l'interfase e il riassemblaggio nucleare post-mitotico e dell'organizzazione strutturale del complesso Y all'interno dell'impalcatura dei pori. Il background U2OS offre una morfologia piatta e nuclei di grandi dimensioni, facilitando l'imaging ad alta risoluzione. Le cellule U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 sono particolarmente adatte per esperimenti di marcatura pulse-chase, microscopia ottica ed elettronica correlativa e approcci di imaging multicolore in combinazione con nucleoporine o fattori di trasporto marcati endogenamente aggiuntivi.

37°C, 5%_CO2, atmosfera umidificata.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

La contaminazione da micoplasma viene esclusa utilizzando sia saggi basati sulla PCR sia metodi di rilevamento del micoplasma basati sulla luminescenza.

Per garantire l'assenza di contaminazione batterica, fungina o da lieviti, le colture cellulari sono sottoposte a ispezioni visive quotidiane.

Per la conservazione a lungo termine, porre le fiale in azoto liquido in fase vapore a una temperatura compresa tra -150 e -196 °C circa. La conservazione a -80 °C è accettabile solo come breve fase intermedia prima del trasferimento in azoto liquido.

Le linee cellulari crioconservate vengono spedite su ghiaccio secco in confezioni isolate e convalidate, con una quantità di refrigerante sufficiente a mantenere circa -78 °C durante il trasporto. Al ricevimento, ispezionare immediatamente il contenitore e trasferire immediatamente le fiale in un luogo di conservazione appropriato.

Noi di Cytion garantiamo la qualità e la vitalità dei nostri prodotti. Garantiamo che le nostre cellule saranno vitali all'inizio della coltura per 60 giorni dopo la spedizione dai nostri stabilimenti. Assicuriamo che tutti i materiali sono conformi alle specifiche descritte nel Certificato di Analisi e/o nella Scheda Prodotto

Per tutti i dettagli, consultare la nostra <a href=""/Chi-siamo/Garanzia/"" hreflang=""x-default"">Dichiarazione di Garanzia