U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 è una linea cellulare di osteosarcoma umano modificata genomicamente derivata dalle cellule U2OS in cui il locus endogeno RANBP2 (noto anche come NUP358) è stato modificato da CRISPR/Cas9 per codificare un tag SNAPf in frame con la proteina nativa. Nup358/RanBP2 è una grande nucleoporina localizzata nei filamenti citoplasmatici del complesso dei pori nucleari (NPC) e svolge un ruolo fondamentale nel trasporto nucleocitoplasmatico, nella SUMOilazione e nei processi mitotici. Il tagging endogeno assicura che SNAPf-Nup358 sia espresso sotto il controllo fisiologico del promotore, mantenendo i livelli di espressione nativi e riducendo al minimo gli artefatti associati ai sistemi di sovraespressione.

Il tag SNAPf è una variante a marcatura rapida del tag SNAP che si lega in modo covalente ai substrati coniugati con benzilguanina, consentendo la marcatura fluorescente selettiva e stabile di Nup358 in cellule vive o fissate. Nelle cellule U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2, la proteina di fusione si localizza nell'involucro nucleare con una distribuzione puntiforme caratteristica dei filamenti NPC citoplasmatici. Questa configurazione supporta l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione, la microscopia a super risoluzione, l'etichettatura pulse-chase e gli approcci di tracciamento di singole molecole per studiare l'architettura e la dinamica dell'NPC. La morfologia piatta e i nuclei di grandi dimensioni delle cellule U2OS facilitano ulteriormente l'imaging quantitativo delle strutture dell'involucro nucleare.

Questo modello consente di studiare i ruoli specifici di Nup358 nell'esportazione nucleare dipendente da CRM1/exportina, nella regolazione del ciclo della GTPasi Ran e nell'organizzazione spaziale delle piattaforme di trasporto citoplasmatico. Dato il coinvolgimento di Nup358 nell'assemblaggio del fuso mitotico e nella funzione del cinetocoro, la linea cellulare è adatta anche per lo studio della ridistribuzione delle nucleoporine dipendente dal ciclo cellulare e del disassemblaggio/riassemblaggio dell'NPC durante la mitosi. U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 fornisce una piattaforma fisiologicamente rilevante per analizzare gli aspetti strutturali e funzionali della faccia citoplasmatica del complesso dei pori nucleari nelle cellule umane.

37°C, 5%_CO2, atmosfera umidificata.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

La contaminazione da micoplasma viene esclusa utilizzando sia saggi basati sulla PCR sia metodi di rilevamento del micoplasma basati sulla luminescenza.

Per garantire l'assenza di contaminazione batterica, fungina o da lieviti, le colture cellulari sono sottoposte a ispezioni visive quotidiane.

Per la conservazione a lungo termine, porre le fiale in azoto liquido in fase vapore a una temperatura compresa tra -150 e -196 °C circa. La conservazione a -80 °C è accettabile solo come breve fase intermedia prima del trasferimento in azoto liquido.

Le linee cellulari crioconservate vengono spedite su ghiaccio secco in confezioni isolate e convalidate, con una quantità di refrigerante sufficiente a mantenere circa -78 °C durante il trasporto. Al ricevimento, ispezionare immediatamente il contenitore e trasferire immediatamente le fiale in un luogo di conservazione appropriato.

Noi di Cytion garantiamo la qualità e la vitalità dei nostri prodotti. Garantiamo che le nostre cellule saranno vitali all'inizio della coltura per 60 giorni dopo la spedizione dai nostri stabilimenti. Assicuriamo che tutti i materiali sono conformi alle specifiche descritte nel Certificato di Analisi e/o nella Scheda Prodotto

Per tutti i dettagli, consultare la nostra <a href=""/Chi-siamo/Garanzia/"" hreflang=""x-default"">Dichiarazione di Garanzia