U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 to zmodyfikowana genetycznie linia komórek ludzkiego osteosarcoma pochodząca z komórek U2OS, w której endogenny locus RANBP2 (znany również jako NUP358) został zmodyfikowany za pomocą CRISPR/Cas9 w celu kodowania tagu SNAPf w ramce z natywnym białkiem. Nup358/RanBP2 jest dużym nukleoporinem zlokalizowanym w cytoplazmatycznych włóknach kompleksu porów jądrowych (NPC) i odgrywa kluczową rolę w transporcie jądrowo-cytoplazmatycznym, SUMOylacji i procesach mitotycznych. Endogeniczne znakowanie zapewnia, że SNAPf-Nup358 jest wyrażany pod fizjologiczną kontrolą promotora, utrzymując natywne poziomy ekspresji i minimalizując artefakty związane z systemami nadekspresji.

Tag SNAPf jest szybko znakującym wariantem tagu SNAP, który kowalencyjnie wiąże substraty sprzężone z benzyloguaniną, umożliwiając selektywne i stabilne znakowanie fluorescencyjne Nup358 w żywych lub utrwalonych komórkach. W komórkach U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 białko fuzyjne lokalizuje się w otoczce jądrowej w postaci punktowej dystrybucji charakterystycznej dla cytoplazmatycznych włókien NPC. Taka konfiguracja umożliwia obrazowanie fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości, mikroskopię superrozdzielczą, znakowanie metodą pulse-chase oraz śledzenie pojedynczych cząsteczek w celu badania architektury i dynamiki NPC. Płaska morfologia i duże jądra komórek U2OS dodatkowo ułatwiają ilościowe obrazowanie struktur błony jądrowej.

Model ten umożliwia badanie specyficznych ról Nup358 w eksporcie jądrowym zależnym od CRM1/eksportyny, regulacji cyklu Ran GTPazy oraz organizacji przestrzennej cytoplazmatycznych platform transportowych. Biorąc pod uwagę udział Nup358 w tworzeniu wrzeciona mitotycznego i funkcji kinetochoru, linia komórkowa nadaje się również do badania zależnej od cyklu komórkowego redystrybucji nukleoporin oraz demontażu/ponownego montażu NPC podczas mitozy. U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 stanowi fizjologicznie istotną platformę do analizy strukturalnych i funkcjonalnych aspektów cytoplazmatycznej powierzchni kompleksu porów jądrowych w komórkach ludzkich.

37°C, 5%_CO2, nawilżona atmosfera.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

Zanieczyszczenie mykoplazmą jest wykluczane przy użyciu zarówno testów opartych na PCR, jak i metod wykrywania mykoplazmy opartych na luminescencji.

Aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia bakteriami, grzybami lub drożdżami, hodowle komórkowe są poddawane codziennym kontrolom wizualnym.

W celu długotrwałego przechowywania należy umieścić fiolki w ciekłym azocie w fazie lotnej w temperaturze od -150 do -196 °C. Przechowywanie w temperaturze -80 °C jest dopuszczalne tylko jako krótki etap przejściowy przed przeniesieniem do ciekłego azotu.

Linie komórkowe poddane kriokonserwacji są wysyłane w suchym lodzie w zatwierdzonych, izolowanych opakowaniach z wystarczającą ilością czynnika chłodniczego, aby utrzymać temperaturę około -78°C przez cały czas transportu. Po otrzymaniu przesyłki należy natychmiast sprawdzić pojemnik i bezzwłocznie przenieść fiolki do odpowiedniego miejsca przechowywania.

W Cytion gwarantujemy jakość i żywotność naszych produktów. Gwarantujemy, że nasze komórki będą żywotne na początku hodowli przez 60 dni po wysyłce z naszych zakładów. Zapewniamy, że wszystkie materiały są zgodne ze specyfikacjami opisanymi w certyfikacie analizy i/lub karcie produktu

Szczegółowe informacje można znaleźć w naszej <a href=""/Who-we-are/Warranty/"" hreflang=""x-default"">Oświadczeniu gwarancyjnym