U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 es una línea celular de osteosarcoma humano editada genómicamente derivada de células U2OS en la que el locus endógeno RANBP2 (también conocido como NUP358) ha sido modificado por CRISPR/Cas9 para codificar una etiqueta SNAPf en marco con la proteína nativa. Nup358/RanBP2 es una nucleoporina grande localizada en los filamentos citoplasmáticos del complejo de poros nucleares (NPC) y desempeña un papel fundamental en el transporte nucleocitoplasmático, la SUMOilación y los procesos mitóticos. El etiquetado endógeno garantiza que SNAPf-Nup358 se exprese bajo el control fisiológico del promotor, manteniendo los niveles de expresión nativos y minimizando los artefactos asociados a los sistemas de sobreexpresión.

La etiqueta SNAPf es una variante de etiquetado rápido de la etiqueta SNAP que se une covalentemente a sustratos conjugados con bencilguanina, lo que permite el etiquetado fluorescente selectivo y estable de Nup358 en células vivas o fijadas. En las células U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2, la proteína de fusión se localiza en la envoltura nuclear con una distribución punteada característica de los filamentos NPC citoplasmáticos. Esta configuración permite realizar imágenes de fluorescencia de alta resolución, microscopía de superresolución, etiquetado pulse-chase y seguimiento de moléculas individuales para estudiar la arquitectura y la dinámica de los NPC. La morfología plana y los núcleos grandes de las células U2OS facilitan aún más la obtención de imágenes cuantitativas de las estructuras de la envoltura nuclear.

Este modelo permite investigar las funciones específicas de Nup358 en la exportación nuclear dependiente de CRM1/exportina, la regulación del ciclo de la GTPasa Ran y la organización espacial de las plataformas de transporte citoplasmático. Dada la participación de Nup358 en el ensamblaje del huso mitótico y la función del cinetocoro, la línea celular también es adecuada para estudiar la redistribución dependiente del ciclo celular de las nucleoporinas y el desensamblaje/reensamblaje del NPC durante la mitosis. U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 proporciona una plataforma fisiológicamente relevante para diseccionar los aspectos estructurales y funcionales de la cara citoplasmática del complejo de poros nucleares en las células humanas.

37°C, 5%_CO2, atmósfera humidificada.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

La contaminación por micoplasma se excluye utilizando tanto ensayos basados en la PCR como métodos de detección de micoplasma basados en la luminiscencia.

Para garantizar la ausencia de contaminación bacteriana, fúngica o por levaduras, los cultivos celulares se someten a inspecciones visuales diarias.

Para la conservación a largo plazo, colocar los viales en nitrógeno líquido en fase vapor a una temperatura aproximada de -150 a -196 °C. El almacenamiento a -80 °C sólo es aceptable como breve paso intermedio antes de la transferencia al nitrógeno líquido.

Las líneas celulares crioconservadas se envían en hielo seco en envases validados y aislados con suficiente refrigerante para mantener aproximadamente -78 °C durante el tránsito. A la recepción, inspeccione el envase inmediatamente y transfiera los viales sin demora al almacenamiento adecuado.

En Cytion, respaldamos la calidad y viabilidad de nuestros productos. Garantizamos que nuestras células serán viables al inicio del cultivo durante los 60 días posteriores al envío desde nuestras instalaciones. Aseguramos que todos los materiales se ajustan a las especificaciones descritas en el Certificado de Análisis y/o Hoja de Producto

Para más información, consulte nuestra <a href=""/Quiénes somos/Garantía/"" hreflang=""x-default"">Declaración de garantía