U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 er en genomredigeret human osteosarkomcellelinje afledt af U2OS-celler, hvor det endogene RANBP2-lokus (også kendt som NUP358) er blevet modificeret ved hjælp af CRISPR/Cas9 til at kode for et SNAPf-tag i rammen med det oprindelige protein. Nup358/RanBP2 er et stort nukleoporin, der er lokaliseret i cytoplasmatiske filamenter i det nukleare porekompleks (NPC) og spiller en afgørende rolle i nukleocytoplasmatisk transport, SUMOylering og mitotiske processer. Endogen mærkning sikrer, at SNAPf-Nup358 udtrykkes under fysiologisk promotorkontrol, hvilket opretholder native ekspressionsniveauer og minimerer artefakter forbundet med overekspressionssystemer.

SNAPf-tagget er en hurtigt mærkende variant af SNAP-tagget, der kovalent binder benzylguanin-konjugerede substrater, hvilket muliggør selektiv og stabil fluorescerende mærkning af Nup358 i levende eller fiksede celler. I U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2-celler lokaliseres fusionsproteinet til kernehinden i en punktformet fordeling, der er karakteristisk for cytoplasmatiske NPC-filamenter. Denne konfiguration understøtter højopløsningsfluorescensbilleddannelse, superopløsningsmikroskopi, puls-chase-mærkning og enkeltmolekylsporing til at studere NPC-arkitektur og -dynamik. Den flade morfologi og de store kerner i U2OS-celler letter yderligere kvantitativ billeddannelse af kernemembranstrukturer.

Denne model muliggør undersøgelse af Nup358-specifikke roller i CRM1/exportin-afhængig nuklear eksport, Ran GTPase-cyklusregulering og den rumlige organisering af cytoplasmatiske transportplatforme. I betragtning af Nup358's involvering i mitotisk spindelmontering og kinetokorfunktion er cellelinjen også velegnet til at studere cellecyklusafhængig omfordeling af nukleoporiner og NPC-demontering/genmontering under mitose. U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup358/RanBP2 udgør en fysiologisk relevant platform til at analysere strukturelle og funktionelle aspekter af den cytoplasmatiske side af kerneporekomplekset i humane celler.

37°C, 5%_CO2, befugtet atmosfære.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

Mycoplasma-kontaminering udelukkes ved hjælp af både PCR-baserede assays og luminescensbaserede mycoplasma-detektionsmetoder.

For at sikre, at der ikke er nogen bakterie-, svampe- eller gærforurening, underkastes cellekulturerne daglige visuelle inspektioner.

For langtidsopbevaring anbringes hætteglas i flydende nitrogen i dampfase ved ca. -150 til -196 °C. Opbevaring ved -80 °C er kun acceptabelt som et kort mellemtrin før overførsel til flydende nitrogen.

Kryopræserverede cellelinjer sendes på tøris i valideret, isoleret emballage med tilstrækkeligt kølemiddel til at opretholde ca. -78 °C under hele transporten. Ved modtagelse skal beholderen straks inspiceres, og hætteglassene skal straks overføres til passende opbevaring.

Hos Cytion står vi inde for vores produkters kvalitet og levedygtighed. Vi garanterer, at vores celler vil være levedygtige ved kulturens start i 60 dage efter afsendelse fra vores faciliteter. Vi sikrer, at alle materialer er i overensstemmelse med de specifikationer, der er beskrevet i analysecertifikatet og/eller produktarket

For alle detaljer henvises til vores <a href=""/Who-we-are/Warranty/"" hreflang=""x-default"">Garantierklæring