U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133

U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 е генетично модифицирана човешка остеосаркомна клетъчна линия, получена от родителския U2OS фон, в която ендогенният локус NUP133 е модифициран чрез CRISPR/Cas9-медиирано редактиране на генома, за да кодира C-терминален SNAPf таг. NUP133 е основен компонент на Y-комплекса (NUP107-160 комплекс), структурен подкомплекс, който е от съществено значение за сглобяването и поддържането на ядрения порен комплекс (NPC). Чрез въвеждането на SNAPf кодиращата последователност в ендогенния локус, фузионният протеин се експресира под естествен регулаторен контрол, запазвайки физиологичните нива на експресия и субклетъчната локализация.

SNAPf тагът е вариант на SNAP-тага за бързо маркиране, инженерно създаден O6-алкилгуанин-ДНК алкилтрансферазен ензим, който ковалентно реагира с бензилгуанин-конюгирани субстрати. Това позволява високоспецифично и гъвкаво флуоресцентно маркиране на Nup133 в живи или фиксирани клетки, използвайки клетъчнопроницаеми или непроницаеми SNAP субстрати. В U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 клетките, фузионният протеин се локализира в ядрената мембрана в характерния за ядрените пори комплекси пунктиран модел. Тъй като маркирането се извършва в ендогенния локус, стехиометрията и архитектурата на NPC са минимално нарушени, което прави този модел подходящ за количествена суперразделителна микроскопия, проследяване на единични молекули и кинетични анализи на сглобяването и обновяването на NPC.

Тази клетъчна линия предоставя стабилна платформа за изучаване на ядрения транспорт, динамиката на нуклеоцитоплазмения трафик, биогенезата на NPC по време на интерфазата и постмитотичното ядрено прегрупиране, както и структурната организация на Y-комплекса в рамките на порестата структура. Фонът на U2OS предлага плоска морфология и големи ядра, което улеснява високоразделителното изображение. Клетките U2OS-CRISPR-SNAPf-Nup133 са особено подходящи за експерименти с маркиране с импулсно проследяване, корелативна светлинна и електронна микроскопия и многоцветни изображения в комбинация с допълнителни ендогенно маркирани нуклеопорини или транспортни фактори.

37°C, 5%_CO2, овлажнена атмосфера.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

Замърсяването с микоплазма се изключва както чрез PCR-базирани анализи, така и чрез луминесцентни методи за откриване на микоплазма.

За да се гарантира, че няма бактериално, гъбично или дрождево замърсяване, клетъчните култури се подлагат на ежедневни визуални проверки.

За дълготрайно съхранение поставете флаконите в течен азот в парна фаза при температура около -150 до -196 °C. Съхранението при -80 °C е приемливо само като кратък междинен етап преди прехвърлянето в течен азот.

Криоконсервираните клетъчни линии се транспортират върху сух лед в утвърдени, изолирани опаковки с достатъчно хладилен агент, за да се поддържа приблизително -78 °C по време на транспортирането. При получаването незабавно прегледайте опаковката и незабавно прехвърлете флаконите за подходящо съхранение.

Ние в Cytion заставаме зад качеството и жизнеспособността на нашите продукти. Гарантираме, че нашите клетки ще бъдат жизнеспособни в началото на култивирането в продължение на 60 дни след изпращането им от нашите съоръжения. Гарантираме, че всички материали отговарят на спецификациите, описани в сертификата за анализ и/или продуктовата листа

За пълни подробности, моля, направете справка с нашата <a href=""/Кои сме ние/Гаранция/"" hreflang=""x-default"">Гаранционна декларация