U2OS-CRISPR-TPR-SNAP

A U2OS-CRISPR-TPR-SNAP é uma linhagem celular de osteossarcoma humano editada genômicamente, derivada de células U2OS, na qual o gene endógeno TPR (Região Promotora Translocada) foi modificado por meio da tecnologia CRISPR/Cas9 para codificar uma marca SNAP em-quadro. A TPR é uma grande nucleoporina do tipo coiled-coil que se localiza na cesta nuclear, no lado nucleoplásmico do complexo de poros nucleares (NPC). Ao marcar a TPR em seu locus endógeno, a proteína de fusão é expressa sob controle regulatório nativo, preservando os níveis fisiológicos de expressão e mantendo a incorporação adequada à estrutura da cesta nuclear.

A etiqueta SNAP permite a marcação covalente da TPR com substratos fluorescentes conjugados à benzilguanina em células vivas ou fixadas, possibilitando uma visualização altamente específica e estável. Em células U2OS-CRISPR-TPR-SNAP, a TPR marcada exibe uma distribuição pontilhada característica em forma de anel no envelope nuclear, correspondendo às estruturas da cesta nuclear associadas ao NPC. Esse sistema é adequado para microscopia de fluorescência quantitativa, imagens de super-resolução, marcação por pulso-perseguição e estudos dinâmicos da montagem e renovação da cesta nuclear. A morfologia achatada e os núcleos grandes das células U2OS facilitam a imagem de alta resolução das estruturas associadas ao envelope nuclear.

A TPR desempenha papéis críticos na exportação de mRNA, na regulação do transporte nuclear, na organização da cromatina na periferia nuclear e na organização espacial do genoma. A TPR também está implicada na formação de subcompartimentos relacionados ao transporte nuclear e na exclusão da heterocromatina de regiões associadas aos poros nucleares. O U2OS-CRISPR-TPR-SNAP oferece um modelo fisiologicamente relevante para analisar a arquitetura e a dinâmica da cesta nuclear, investigar mecanismos de tráfego nucleocitoplasmático e estudar as interações da cromatina associadas ao envelope nuclear em condições de expressão endógena.

37 °C, 5% de CO₂, atmosfera umidificada.

1. Confirm that the vial remains deeply frozen upon delivery, as cells are shipped on dry ice to maintain optimal temperatures during transit.

2. Upon receipt, either store the cryovial immediately at temperatures below -150°C to ensure the preservation of cellular integrity, or proceed to step 3 if immediate culturing is required.

3. For immediate culturing, swiftly thaw the vial by immersing it in a 37°C water bath with clean water and an antimicrobial agent, agitating gently for 40-60 seconds until a small ice clump remains.

4. Perform all subsequent steps under sterile conditions in a flow hood, disinfecting the cryovial with 70% ethanol before opening.

5. Carefully open the disinfected vial and transfer the cell suspension into a 15 ml centrifuge tube containing 8 ml of room-temperature culture medium, mixing gently.

6. Centrifuge the mixture at 300 x g for 3 minutes to separate the cells and carefully discard the supernatant containing residual freezing medium.

7. Gently resuspend the cell pellet in 10 ml of fresh culture medium. For adherent cells, divide the suspension between two T25 culture flasks; for suspension cultures, transfer all the medium into one T25 flask to promote effective cell interaction and growth.

8. Adhere to established subculture protocols for continued growth and maintenance of the cell line, ensuring reliable experimental outcomes.

A contaminação por micoplasma é descartada por meio de ensaios baseados em PCR e de métodos de detecção de micoplasma baseados em luminescência.

Para garantir que não haja contaminação por bactérias, fungos ou leveduras, as culturas celulares são submetidas a inspeções visuais diárias.

Para preservação a longo prazo, coloque os frascos em nitrogênio líquido em fase de vapor a uma temperatura entre aproximadamente −150 e −196 °C. O armazenamento a −80 °C é aceitável apenas como uma etapa intermediária de curta duração antes da transferência para o nitrogênio líquido.

As linhagens celulares criopreservadas são enviadas em gelo seco, em embalagens isoladas e validadas, com refrigerante suficiente para manter a temperatura em aproximadamente −78 °C durante todo o transporte. Ao receber a remessa, inspecione o recipiente imediatamente e transfira os frascos sem demora para o local de armazenamento adequado.

Na Cytion, garantimos a qualidade e a viabilidade de nossos produtos. Garantimos que nossas células permanecerão viáveis no início da cultura por 60 dias após o envio de nossas instalações. Asseguramos que todos os materiais estão em conformidade com as especificações descritas no Certificado de Análise e/ou na Ficha Técnica do Produto.

Para obter todos os detalhes, consulte nossa Declaração de Garantia.