Εισαγωγή

Το Κύτταρα 3T6-Swiss αλμπίνο, γνωστή επίσης ως Swiss 3T6, NIH 3T6, 3T6 και GM05862, αποτελεί μία από τις πιο μακροβιότερες αυθόρμητα αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές ινοβλαστών ποντικού στη βιοϊατρική έρευνα. Η σειρά αυτή, που δημιουργήθηκε το 1963 από τους Todaro και Green από αποσυντεθειμένα έμβρυα ποντικιών της φυλής Swiss, ήταν από τις πρώτες που απέδειξαν ότι τα πρωτογενή κύτταρα εμβρύων ποντικιών μπορούσαν να υποστούν αυθόρμητη αθανατοποίηση υπό καθορισμένες συνθήκες διαβίβασης [1]. Κατά τις επόμενες δεκαετίες, οι ερευνητές έχουν χρησιμοποιήσει τα αλμπίνο κύτταρα 3T6-Swiss σε ένα εξαιρετικά ευρύ φάσμα επιστημονικών κλάδων, όπως η ιολογία, η επιδιόρθωση του DNA, ο μεταβολισμός των νουκλεοτιδίων, η βιολογία των υποδοχέων και η αξιολόγηση βιοϋλικών. Ο γρήγορος χρόνος διπλασιασμού της κυτταρικής σειράς, τα ισχυρά χαρακτηριστικά ανάπτυξής της και η ινοβλαστική μορφολογία της την καθιστούν ένα εύχρηστο πειραματικό μοντέλο. Η καλά χαρακτηρισμένη ανταπόκρισή της σε αυξητικούς παράγοντες και μιτογόνα την έχει επίσης καταστήσει ένα προτιμώμενο εργαλείο για τη μελέτη της μεταγωγής σήματος και της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου σε μη μετασχηματισμένα έναντι αυθόρμητα μετασχηματισμένων ινοβλαστικών υποβάθρων.

Κύρια συμπεράσματα

• Η 3T6-Swiss albino είναι μια αυθόρμητα αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά ινοβλαστών ποντικού, η οποία δημιουργήθηκε το 1963 από έμβρυα ποντικού της φυλής Swiss από τους Todaro και Green.
• Η κυτταρική σειρά φέρει τον αριθμό καταχώρισης CVCL_0601 του Cellosaurus και χαρακτηρίζεται από έναν εξαιρετικά γρήγορο χρόνο διπλασιασμού, περίπου 15 ώρες.
• Ο κωδικός «3T6» υποδηλώνει το πρόγραμμα καλλιέργειας που χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή του: μεταφορά κάθε 3 ημέρες με εμβολιασμό 6 × 10⁵ κύτταρα ανά πλάκα.
• Έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε μελέτες ιολογίας, ιδίως για την έρευνα σχετικά με τη μεταγραφή, την αναπαραγωγή και τις πρωτεΐνες του καψιδίου του πολυομαϊού.
• Η σειρά αυτή αποτελεί ένα αξιόπιστο μοντέλο για τη μελέτη των μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA, της σηματοδότησης των αυξητικών παραγόντων και της βιοσύνθεσης των νουκλεοτιδίων.
• Τα κύτταρα 3T6-Swiss albino είναι ευαίσθητα σε ενδοκυτταρική βακτηριακή λοίμωξη, γεγονός που τα καθιστά χρήσιμα για μελέτες αλληλεπίδρασης ξενιστή-παθογόνου.
• Η σειρά έχει αξιολογηθεί ως προς τη βιοσυμβατότητα και την κυτταροτοξικότητα στο πλαίσιο της έρευνας στον τομέα των βιοϋλικών και της επούλωσης τραυμάτων.

Τι είναι το 3T6-Swiss albino;

Η σειρά 3T6-Swiss albino (CVCL_0601) προήλθε από ιστό ολόκληρου εμβρύου ποντικών της σειράς Swiss albino· σύμφωνα με τα αρχεία του Cellosaurus, το φύλο της σειράς είναι αρσενικό. Οι αρχικές καλλιέργειες παρασκευάστηκαν με τον τεμαχισμό συγκεντρωμένων εμβρύων ποντικών της σειράς Swiss ηλικίας 17 έως 19 ημερών, οπότε η σειρά δεν προέρχεται από ένα μόνο ταυτοποιημένο ζώο-δότη [1]. Η κυτταρική σειρά δημιουργήθηκε μέσω του ιστορικού πρωτοκόλλου 3T που επινόησαν οι Todaro και Green, στο πλαίσιο του οποίου πρωτογενή κύτταρα εμβρύων ποντικού υποβλήθηκαν σε διαδοχικές μεταμοσχεύσεις σε σταθερά χρονικά διαστήματα και πυκνότητες εμβολιασμού, έως ότου επέλθει αυθόρμητη αθανατοποίηση. Η ονοματολογία αντανακλά άμεσα αυτή τη μέθοδο: το «3T» υποδηλώνει μεταφορά σε διαστήματα τριών ημερών, ενώ ο δεύτερος αριθμός υποδηλώνει το εμβόλιο σε μονάδες των 10⁵ κύτταρα ανά πλάκα. Συνεπώς, η σειρά 3T6 διατηρήθηκε σε 6 × 10⁵ κύτταρα ανά πλάκα, μαζί με τις αδελφικές σειρές 3T3 (3 × 10⁵) και 3T12 (12 × 10⁵) που περιγράφεται στην ίδια μελέτη [1].

Οι συνθήκες καλλιέργειας που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της δημιουργίας των σειρών διαμόρφωσαν τον τελικό φαινότυπο. Ενώ η σειρά 3T3 διατηρήθηκε σκόπιμα αραιή και δεν της επιτράπηκε ποτέ να φτάσει σε πλήρη κάλυψη — με αποτέλεσμα τη δημιουργία μιας σειράς που παρουσιάζει εξαιρετικά έντονη αναστολή επαφής — οι σειρές που διατηρήθηκαν σε υψηλότερες πυκνότητες έχασαν σταδιακά την αναστολή επαφής, σχημάτισαν πολυστρωματικές καλλιέργειες και έφτασαν σε πολύ υψηλότερες πυκνότητες κορεσμού [1]. Ως εκ τούτου, οι τράπεζες κυττάρων περιγράφουν τη σειρά 3T6 ως μη ανασταλόμενη από επαφή, σε σαφή αντίθεση με τη σειρά 3T3. Όπως όλες οι καθιερωμένες σειρές ποντικών σε αυτή τη μελέτη, έτσι και η 3T6 μεταβλήθηκε από διπλοειδή σε ετεροπλοειδή καρυότυπο κατά τη διάρκεια της καθιέρωσής της, καταλήγοντας στο εύρος του υποτετραπλοειδούς· οι τράπεζες κυττάρων αναφέρουν έναν ασταθή καρυότυπο με βασική σειρά 78–81 χρωμοσωμάτων. Η σειρά παράγει κολλαγόνο και υαλουρονικό οξύ, διατηρώντας ορισμένα χαρακτηριστικά του συνδετικού ιστού που αντανακλούν την ινοβλαστική της προέλευση. Η ταυτότητα του είδους έχει επιβεβαιωθεί μέσω αλληλούχισης υψηλής απόδοσης που στοχεύει στο γονίδιο της υπομονάδας 1 της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (COX1), παρέχοντας ανεξάρτητη μοριακή πιστοποίηση της ποντικικής προέλευσης [2].

Πληροφορίες για την καλλιέργεια κυττάρων

Πλεονεκτήματα των κυττάρων 3T6-Swiss albino

Ένα από τα πιο πρακτικά πλεονεκτήματα των αλμπίνο κυττάρων 3T6-Swiss είναι ο γρήγορος ρυθμός πολλαπλασιασμού τους. Οι Todaro και Green κατέγραψαν πώς ο χρόνος παραγωγής της αναδυόμενης σειράς 3T6 μειώθηκε από 29 ώρες σε 15 ώρες κατά τη διάρκεια οκτώ διαδοχικών μεταφορών, αφού ο πληθυσμός είχε καταστεί πλήρως ετεροπλοειδής, ενώ στην ίδια σειρά καταγράφηκαν τιμές κάτω των 14 ωρών [1]. Συνεπώς, οι τράπεζες κυττάρων αναφέρουν χρόνο διπλασιασμού περίπου 15 ωρών. Αυτό διευκολύνει τις πειραματικές ροές εργασίας υψηλής απόδοσης και μειώνει τον χρόνο που απαιτείται για την παραγωγή επαρκούς αριθμού κυττάρων για τις αναλύσεις, ενώ ο τρόπος ανάπτυξης σε προσκολλημένη μονοστρωματική μορφή διευκολύνει την απλή μικροσκοπική παρατήρηση και χειρισμό.

Η ευρεία πειραματική ευελιξία των αλμπίνο κυττάρων 3T6-Swiss αποτελεί ένα δεύτερο σημαντικό πλεονέκτημα. Η κυτταρική σειρά υποστηρίζει σταθερή και παροδική μεταμόλυνση με μια σειρά κατασκευασμάτων έκφρασης, έχει χρησιμοποιηθεί για την παραγωγική πολλαπλασιασμό πολυομαϊών και ανταποκρίνεται αξιόπιστα σε εξωκυτταρικά ερεθίσματα, όπως αυξητικοί παράγοντες και πουρινεργικοί αγωνιστές. Αυτή η ευελιξία σημαίνει ότι μια μόνο κυτταρική σειρά μπορεί να καλύψει πολλαπλές πειραματικές ανάγκες εντός ενός εργαστηρίου, μειώνοντας το βάρος της διατήρησης πολυάριθμων διακριτών αποθεμάτων κυττάρων. Επιπλέον, η σειρά έχει αποδείξει τη χρησιμότητά της σε ένα ευρύ φάσμα επιστημονικών κλάδων — από τη μοριακή ιολογία έως τις δοκιμές βιοϋλικών — υπογραμμίζοντας την ευρεία εφαρμοσιμότητά της.

Περιορισμοί των κυττάρων 3T6-Swiss albino

Ως αυθόρμητα αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά που έχασε την αναστολή επαφής κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, τα αλμπίνο κύτταρα 3T6-Swiss φτάνουν σε πολύ υψηλότερες πυκνότητες κορεσμού από τους φυσιολογικούς ινοβλάστες και δεν παρουσιάζουν την εξαρτώμενη από την πυκνότητα διακοπή της ανάπτυξης που παρατηρείται σε καλλιέργειες με αναστολή επαφής [1]. Ως εκ τούτου, δεν αναπαράγουν τις αντιδράσεις αναστολής επαφής που παρατηρούνται σε σειρές όπως η 3T3, κάτι που μπορεί να αποτελέσει κρίσιμο παράγοντα κατά τον σχεδιασμό πειραμάτων που αποσκοπούν στην αναπαραγωγή της φυσιολογίας των φυσιολογικών ιστών. Οι ερευνητές που μελετούν την καταστολή όγκων, τον έλεγχο της ανάπτυξης που εξαρτάται από την πρόσφυση ή τις φυσιολογικές αντιδράσεις επούλωσης τραυμάτων θα πρέπει να επιδεικνύουν προσοχή κατά την ερμηνεία των αποτελεσμάτων από αυτή τη σειρά. Ο καρυότυπος αποτελεί έναν σχετικό περιορισμό: η σειρά 3T6 είναι ετεροπλοειδής και όχι διπλοειδής, με ασταθές χρωμοσωμικό συμπλήρωμα στην περιοχή του υποτετραπλοειδούς, επομένως δεν αποτελεί κατάλληλο υπόβαθρο για εργασίες που απαιτούν ευπλοειδές γονιδίωμα.

Ένας επιπλέον περιορισμός αφορά τον ποντικό, εμβρυϊκό και ινοβλαστικό χαρακτήρα του μοντέλου. Τα ευρήματα που προκύπτουν από τα αλμπίνο κύτταρα 3T6-Swiss ενδέχεται να μην μπορούν να μεταφραστούν άμεσα στη βιολογία των ανθρώπινων κυττάρων ή σε διαφοροποιημένους κυτταρικούς τύπους. Όπως συμβαίνει με όλες τις συνεχείς κυτταρικές σειρές, η γονιδιωματική μετατόπιση μετά από μεγάλο αριθμό πασάζων μπορεί να προκαλέσει φαινοτυπική μεταβλητότητα. Συνιστάται, επομένως, η τακτική πιστοποίηση για την επιβεβαίωση της ταυτότητας του είδους και τον εντοπισμό πιθανών περιστατικών διασταυρούμενης μόλυνσης με την πάροδο του χρόνου. Σημειώνεται ότι η ανάλυση προφίλ σύντομων επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών (STR), που αποτελεί το πρότυπο αναφοράς για τις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, δεν είναι εφαρμόσιμη στην περίπτωση αυτή· για τις μη ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, η καθιερωμένη προσέγγιση είναι η χρήση γραμμωτού κώδικα DNA του γονιδίου COX1, και η σειρά 3T6 έχει πιστοποιηθεί ακριβώς με αυτή τη μέθοδο [2].

Δείτε τις πλήρεις προδιαγραφές και κάντε την παραγγελία σας

Εφαρμογές

Ιολογία και έκφραση ιικών γονιδίων

Τα κύτταρα 3T6-Swiss albino έχουν χρησιμεύσει ως παραγωγικό σύστημα ξενιστή για την έρευνα σχετικά με τον πολυομαϊό για αρκετές δεκαετίες. Οι Hyde-DeRuyscher και Carmichael χρησιμοποίησαν κύτταρα NIH 3T6 για να διεξάγουν λεπτομερείς δοκιμασίες πυρηνικής συνέχισης (nuclear run-on) και να αναλύσουν τη χρονική ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων του πολυομαϊού κατά τη διάρκεια παραγωγικής μόλυνσης [3]. Η εργασία τους απέδειξε ότι η μετάβαση του πολυομαϊού από την πρώιμη στη όψιμη φάση δεν ρυθμιζόταν στο επίπεδο της έναρξης της μεταγραφής. Αντίθετα, η μετάβαση αυτή συσχετιζόταν με αλλαγές στην επεξεργασία του RNA, ένα εύρημα που διαμόρφωσε θεμελιωδώς την κατανόηση της ρύθμισης των ιικών γονιδίων στους ινοβλάστες ποντικού.

Οι Rhee και Carmichael αξιοποίησαν το σύστημα μόλυνσης NIH 3T6 για να διερευνήσουν τις μεταφραστικές αποδόσεις των mRNA των όψιμων γονιδίων του πολυομαϊού. Πραγματοποίησαν συνμόλυνση κυττάρων με δύο ιικά στελέχη που διέφεραν μόνο ως προς τις 5' μη κωδικοποιούσες αλληλουχίες του όψιμου ηγετικού εξονίου και απομόνωσαν πολυσωμάτια σε όψιμα χρονικά σημεία της μόλυνσης [4]. Τα πειράματά τους για τη χαρτογράφηση των πολυσωμάτων κατέδειξαν ότι η αλληλουχία του «late leader» δεν επηρέαζε την αποτελεσματικότητα της μετάφρασης, προσφέροντας μια σημαντική μηχανιστική εικόνα σχετικά με τη χρήση του ιικού mRNA.

Σε μια συμπληρωματική μελέτη, οι Chang και συνεργάτες εντόπισαν ένα σήμα πυρηνικής εντόπισης (NLS) στην C-τερματική περιοχή της δευτερεύουσας πρωτεΐνης καψιδίου VP2 του πολυομαϊού, χρησιμοποιώντας δύο συγκλίνουσες στρατηγικές [5]. Στη γενετική «αφαιρετική» προσέγγιση, κατασκευάσματα VP2 πλήρους μήκους και περικομμένα μεταφέρθηκαν σε κύτταρα COS-7, δείχνοντας ότι η αφαίρεση των υπολειμμάτων Glu307–Leu318 περιόριζε την VP2 στο κυτταρόπλασμα. Η βιοχημική «προσθετική» προσέγγιση βασίστηκε σε κύτταρα NIH 3T6: ένα συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχούσε στην εν λόγω αλληλουχία διασυνδέθηκε με αλβουμίνη βοείου ορού και ανοσοσφαιρίνη G, σημασμένο με φθορισμό και μικροεγχύθηκε στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων 3T6, όπου και τα δύο συζεύγματα συσσωρεύτηκαν στον πυρήνα, ενώ οι μη συζευγμένες πρωτεΐνες-φορείς δεν το έκαναν. Η καταλληλότητα των κυττάρων 3T6 για μικροέγχυση στο κυτταρόπλασμα ήταν επομένως καθοριστική για την αναγνώριση της NLS.

Επισκευή του DNA και σηματοδότηση αυξητικών παραγόντων

Τα κύτταρα 3T6-Swiss albino έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη μελέτη της επιδιόρθωσης των θραύσεων αλυσίδων DNA που προκαλούνται από ιονίζουσα ακτινοβολία και του ρόλου των αυξητικών παραγόντων στη ρύθμιση αυτής της διαδικασίας. Οι Bildin, Seregina και Zhestyanikov εξέτασαν την κινητική της επιδιόρθωσης των θραύσεων μονής αλυσίδας (SSB) και διπλής αλυσίδας (DSB) σε κύτταρα Swiss 3T6 που εκτέθηκαν σε ιονίζουσα ακτινοβολία σε δόσεις 5–10 Gy [6]. Χρησιμοποίησαν ουδέτερη και αλκαλική έκπλυση, σε συνδυασμό με αλκαλική φυγοκέντρηση σε κλίση σακχαρόζης, για την ποσοτικοποίηση των θραυσμάτων. Τα ευρήματά τους αποκάλυψαν ότι η στέρηση ορού μείωσε δραστικά τους ρυθμούς επιδιόρθωσης, ενώ η εκ νέου διέγερση με επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF) και ινσουλίνη τους αποκατέστησε εν μέρει, αποδεικνύοντας την άμεση σχέση μεταξύ της μιτογόνου σηματοδότησης και της ικανότητας επιδιόρθωσης της βλάβης του DNA.

Μια μεταγενέστερη μελέτη των Bil'din, Seregina και Zhestianikov επέκτεινε αυτή την εργασία, χαρακτηρίζοντας τις συγκεκριμένες DNA πολυμεράσες που εμπλέκονται στην επαγόμενη από ακτινοβολία επιδιόρθωση SSB σε πολλαπλασιαζόμενα, αδρανή και διεγερμένα με μιτογόνο κύτταρα Swiss 3T6 [7]. Χρησιμοποιώντας αφιδικολίνη, έναν ειδικό αναστολέα των DNA πολυμερασών άλφα και δέλτα, και 2',3'-διδεοξυθυμιδίνη-5'-τριφωσφορικό για την αναστολή της DNA πολυμεράσης βήτα, διαπίστωσαν ότι η επιδιόρθωση των SSB ήταν πιο ευαίσθητη στην αφιδικολίνη ανεξάρτητα από την κατάσταση πολλαπλασιασμού. Η αφιδικολίνη ανέστειλε την αποκατάσταση του DNA περίπου τρεις φορές πιο αποτελεσματικά σε κύτταρα σε κατάσταση ηρεμίας και σε κύτταρα που διεγέρθηκαν με μιτογόνο σε σύγκριση με τα κύτταρα που πολλαπλασιάζονταν ενεργά, υποδεικνύοντας ότι μια πολυμεράση ευαίσθητη στην αφιδικολίνη — πιθανότατα η DNA πολυμεράση άλφα — αποτελεί το στάδιο που περιορίζει την επιδιόρθωση στα κύτταρα σε κατάσταση ηρεμίας.

Στον τομέα του μεταβολισμού των νουκλεοτιδίων, ο Tatibana και οι συνεργάτες του μελέτησαν την πρώιμη μιτογενή διέγερση της μεταβολικής ροής μέσω του φωσφοριβοσυλ πυροφωσφορικού (PRPP) προς τα νουκλεοτίδια [8]. Εργαζόμενοι κυρίως σε κύτταρα Swiss 3T3, έδειξαν ότι ο EGF σε συνδυασμό με την ινσουλίνη ενίσχυε τη ροή μέσω του PRPP περίπου κατά δύο φορές και ότι η είσοδος εξωτερικού μαγνησίου ήταν απαραίτητη για την απόκριση. Τα αδρανή κύτταρα Swiss 3T6 εξετάστηκαν παράλληλα με ανθρώπινους εμβρυϊκούς ινοβλάστες και παρουσίασαν συγκρίσιμη διέγερση της σύνθεσης νουκλεοτιδίων κατά την έκθεση στον ορό, τοποθετώντας τα 3T6 απευθείας στη σειρά των πειραμάτων και καταδεικνύοντας πώς ενεργοποιείται η de novo βιοσύνθεση πουρινών και πυριμιδινών ως πρώιμη απόκριση στη μιτογόνο διέγερση.

Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και διαφοροποίηση

Μια μελέτη-ορόσημο των Kleuser και Adam συνέκρινε άμεσα τα κύτταρα Swiss 3T3 και 3T6 για να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ της περιεκτικότητας σε ριβοσωμικό RNA, του μεγέθους των κυττάρων και της εισόδου στον κυτταρικό κύκλο [9]. Τα ευρήματά τους αποκάλυψαν μια θεμελιώδη βιολογική διαφορά μεταξύ των δύο σειρών: τα κύτταρα 3T3 απαιτούσαν ένα κατώφλι περιεκτικότητας σε κυτταρικό rRNA πριν επανενταχθούν στον κυτταρικό κύκλο, ενώ τα κύτταρα 3T6 ξεκινούσαν την αντιγραφή του DNA χωρίς σημαντική αύξηση του rRNA. Αυτή η διαφορά ερμηνεύτηκε ως απόδειξη ότι ο μετασχηματισμός των 3T6 συνεπαγόταν αποσύνδεση από το σημείο ελέγχου μεγέθους που κανονικά ρυθμίζει την είσοδο στον κυτταρικό κύκλο, παρέχοντας μηχανιστική κατανόηση του μετασχηματισμένου φαινοτύπου αυτής της κυτταρικής σειράς.

Οι Thayer και συνεργάτες απέδειξαν ότι η μεταμόλυνση του γονιδίου μυογενούς καθορισμού MyoD1 ενεργοποιεί την έκφραση του ενδογενούς γονιδίου MyoD1, υποδηλώνοντας θετική αυτορύθμιση [10]. Το κύριο πειραματικό σύστημα ήταν η σειρά 10T1/2, αλλά η επίδραση στο ενδογενές mRNA του MyoD1 αναπαράχθηκε σε κύτταρα Swiss 3T6 — συγκεκριμένα, η μόνη επιπλέον σειρά μεταξύ αρκετών σειρών ινοβλαστών και λιποβλαστών που δοκιμάστηκαν, στην οποία παρατηρήθηκε αυτό το φαινόμενο. Αυτή η ειδικότητα καθιστά τη σειρά 3T6 ένα ενημερωτικό και ευνοϊκό υπόβαθρο για μελέτες μυογενούς μετατροπής. Η ίδια εργασία έδειξε ότι το MyoD1 και η μυογενίνη συμμετέχουν σε έναν θετικό αυτορυθμιστικό βρόχο, μια μηχανιστική συμβολή στην κατανόηση της μυογενούς δέσμευσης που δημοσιεύθηκε στο περιοδικό Cell.

Οι Chin και Liem χρησιμοποίησαν κύτταρα Swiss 3T6, παράλληλα με κύτταρα ποντικού L ^tk−, ως σταθερό ξενιστή μεταμόλυνσης για να μελετήσουν την έκφραση των πρωτεϊνών νευροφιλαμεντών αρουραίου NF-L και NF-M σε ένα μη νευρωνικό κυτταρικό πλαίσιο [11]. Τα cDNA των νευροφιλαμεντών ενεργοποιούνταν από τους προαγωγείς του ιού SV40 και του ιού του σαρκώματος Rous, ενώ ένας πρώιμος προαγωγέας του SV40 ενεργοποιούσε τον δείκτη επιλογής με νεομυκίνη. Ανακτήθηκαν κλώνοι ανθεκτικοί στο G418 τόσο με τα κατασκευάσματα NF-L όσο και με τα NF-M, αλλά μόνο κλώνοι που εξέφραζαν το ανιχνεύσιμο με ανοσοφθορισμό NF-M μπόρεσαν να καθιερωθούν· η ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία έδειξε ότι το NF-M συνεντοπίζεται με τη βιμεντίνη στα ίδια ενδιάμεσα νημάτια. Ξεχωριστά, οι Gonzalez και συνεργάτες χρησιμοποίησαν ινοβλάστες ποντικού Swiss 3T6 για να χαρακτηρίσουν δύο διακριτές οδούς σηματοδότησης που μεσολαβούνται από υποδοχείς ATP και ρυθμίζουν την εκροή ασβεστίου και τη διαπερατότητα της πλασματικής μεμβράνης, αποδεικνύοντας επιλεκτική απευαισθητοποίηση μεταξύ των οδών, η οποία συνάδει με την ύπαρξη πολλαπλών πουρινοϋποδοχέων σε αυτά τα κύτταρα [12].

Αλληλεπιδράσεις ξενιστή–παθογόνου

Τα αλμπίνο κύτταρα 3T6-Swiss έχουν αποδειχθεί ένα παραγωγικό in vitro μοντέλο για τη μελέτη ενδοκυτταρικών βακτηριακών παθογόνων, ιδίως του Spiroplasma eriocheiris. Οι Hou και συνεργάτες απέδειξαν ότι το S. eriocheiris μπορούσε να εισβάλει σε κύτταρα 3T6, να σχηματίσει σώματα εγκλεισμού και να προκαλέσει κενόποίηση, όπως απεικονίστηκε με ανοσοφθορισμό και ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης [13]. Η κυτταρομετρία ροής και οι δοκιμασίες MTT επιβεβαίωσαν ότι η μόλυνση προκάλεσε απόπτωση και μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Τα μολυσματικά βακτήρια ήταν ανιχνεύσιμα ήδη μία ώρα μετά τη μόλυνση και ο αριθμός τους αυξήθηκε απότομα έως τις 12 ώρες. Η ανάλυση προφίλ έκφρασης mRNA και microRNA σε ζεύγη από μολυσμένα κύτταρα 3T6 εντόπισε 619 μεταγραφικά προϊόντα με διαφοροποιημένη έκφραση και 22 miRNA με διαφοροποιημένη έκφραση μετά από έξι ώρες, τα οποία συγκλίνουν στις οδούς σηματοδότησης της εστιακής προσκόλλησης και της MAPK.

Οι μοριακοί μηχανισμοί αυτής της αλληλεπίδρασης έχουν αναλυθεί περαιτέρω στο ίδιο κυτταρικό μοντέλο. Οι Hou και συνεργάτες εντόπισαν μια πρωτεΐνη τύπου προσκολλητίνης (ALP) στην εξωτερική μεμβράνη του S. eriocheiris και έδειξαν ότι είναι απαραίτητη για τη μόλυνση των κυττάρων 3T6-Swiss albino [14]. Η ανίχνευση με τη μέθοδο δύο υβριδίων ζύμης, η μέθοδος far-western blotting και πειράματα συντοπισμού απέδειξαν ότι η ALP συνδέεται με τον τομέα EGF της πρωτεΐνης fibulin-7 του ποντικιού και ότι η ανασυνδυασμένη ALP καταστέλλει τη δραστηριότητα της οδού EGFR στα κύτταρα 3T6 μέσω ανταγωνισμού με τον EGF — ένα εντυπωσιακό παράδειγμα βακτηριακής επιφανειακής πρωτεΐνης που εκμεταλλεύεται έναν άξονα αυξητικών παραγόντων του ξενιστή. Σε μια συμπληρωματική μελέτη, οι Zhu και συνεργάτες χαρακτήρισαν μια λυσοφωσφολιπάση του S. eriocheiris, επισημαίνοντας την ικανότητα του οργανισμού να εισβάλλει και να επιβιώνει εντός των κυττάρων 3T6 ποντικού, και έδειξαν μέσω εξουδετέρωσης με αντισώματα ότι το ένζυμο συμβάλλει στη μολυσματικότητα κατά τη διάρκεια της πρώιμης μόλυνσης [15]. Συνολικά, αυτές οι μελέτες καθιερώνουν τα κύτταρα 3T6-Swiss albino ως ένα αναπαραγώγιμο μοντέλο θηλαστικών για την έρευνα σχετικά με τη μόλυνση από Spiroplasma.

Αξιολόγηση βιοϋλικών και εφαρμογές βιοαισθητήρων

Η ισχυρή ανάπτυξη και τα ινοβλαστικά χαρακτηριστικά των κυττάρων 3T6-Swiss albino τα έχουν καταστήσει ένα χρήσιμο μοντέλο για την αξιολόγηση της βιοσυμβατότητας νέων βιοϋλικών. Οι Rathinavel και συνεργάτες αξιολόγησαν ηλεκτρονηματοποιημένα σύνθετα νανοϋποστρώματα που περιείχαν μεσοπορώδη πυριτία (SBA-15), πολυκαπρολακτόνη και κουρκουμίνη για εφαρμογές επούλωσης πληγών [16]. Η κυτταρική μετανάστευση, ο πολλαπλασιασμός και η βιοσυμβατότητα αξιολογήθηκαν σε κύτταρα Swiss 3T6 χρησιμοποιώντας δοκιμασίες κυτταρικής προσκόλλησης και ζωντανών/νεκρών κυττάρων, συμπληρώνοντας τις αντιβακτηριακές δοκιμές και ένα in vivo μοντέλο πληγής σε αρουραίους. Η μελέτη ανέδειξε την πρακτική χρησιμότητα των αλμπίνο κυττάρων 3T6-Swiss ως πλατφόρμας διαλογής για υποψήφια βιοϋλικά επούλωσης πληγών.

Πέρα από τις δοκιμές υλικών, τα αλμπίνο κύτταρα 3T6-Swiss έχουν χρησιμοποιηθεί στην έρευνα για βιοαισθητήρες με βάση τα κύτταρα. Οι Nicolini και συνεργάτες χρησιμοποίησαν έναν ποτενσιομετρικό εναλλασσόμενο βιοαισθητήρα (PAB) με βάση το πυρίτιο — μια διαμόρφωση μετατροπέα ευαίσθητου στο pH που ενεργοποιείται με φως — για την παρακολούθηση των ρυθμών εξωκυτταρικής οξίνισης σε πραγματικό χρόνο ως ένδειξη της τοξικότητας των φαρμάκων [17]. Παράλληλα με πρωτογενή ηπατοκύτταρα αρουραίου και κύτταρα ηπατώματος HepG2 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μιτοξαντρόνη, οι συγγραφείς κατέγραψαν μεταβολές στον ρυθμό οξίνισης των ινοβλαστών ποντικού 3T6 μετά από θεραπεία με τον αντιμεταβολίτη του DNA κυταραβίνη (Ara-C) και συνέκριναν τις ενδείξεις του αισθητήρα με αυτές της συμβατικής οπτικής μικροσκοπίας, με τις δοκιμασίες «Neutral Red» και «Trypan Blue». Η σειρά αυτή ήταν ιδιαίτερα κατάλληλη για τα πειράματα αυτά λόγω της προβλέψιμης μεταβολικής της δραστηριότητας και της ευκολίας καλλιέργειάς της σε υποστρώματα αισθητήρων. Συνολικά, οι εφαρμογές αυτές καταδεικνύουν ότι τα αλμπίνο κύτταρα 3T6-Swiss καταλαμβάνουν μια χρήσιμη θέση στη μεταφραστική έρευνα, γεφυρώνοντας τη κυτταρική βιολογία και την επιστήμη των υλικών.

Συμπέρασμα

Τα αλμπίνο κύτταρα 3T6-Swiss (CVCL_0601) αποτελούν μια εξαιρετικά ευέλικτη και ιστορικά σημαντική κυτταρική σειρά ινοβλαστών ποντικού. Η σειρά δημιουργήθηκε αρχικά από έμβρυα ποντικού Swiss από τους Todaro και Green το 1963, με σχήμα μεταφοράς τριών ημερών σε πυκνότητα 6 × 10⁵ κύτταρα ανά πλάκα, και έχει συγκεντρώσει εκτενή βιβλιογραφία που καλύπτει την ιολογία, την επιδιόρθωση του DNA, τη βιολογία του κυτταρικού κύκλου, τη μυογενή διαφοροποίηση, τη σηματοδότηση των υποδοχέων, τις αλληλεπιδράσεις ξενιστή-παθογόνου και την αξιολόγηση βιοϋλικών. Ο γρήγορος χρόνος διπλασιασμού της, η ευαισθησία της σε παραγωγική ιογενή μόλυνση και η ανταπόκρισή της σε αυξητικούς παράγοντες και μιτογόνα την καθιστούν ένα εύχρηστο και πειραματικά ευέλικτο μοντέλο. Είτε ο στόχος είναι η μελέτη της μεταγραφής του πολυοϊού, η διερεύνηση της επιδιόρθωσης θραυσμάτων αλυσίδων DNA που προκαλούνται από ακτινοβολία και ρυθμίζονται από τον EGF, η αξιολόγηση της βιοσυμβατότητας καινοτόμων υποστρωμάτων επούλωσης πληγών, είτε η εκτίμηση της ενδοκυτταρικής βακτηριακής παθογένεσης, τα κύτταρα 3T6-Swiss albino προσφέρουν μια καλά επικυρωμένη και αναπαραγώγιμη πειραματική πλατφόρμα. Οι ερευνητές που επιθυμούν να ενσωματώσουν αυτή τη κυτταρική σειρά στα προγράμματά τους μπορούν να εξερευνήσουν τις πλήρεις προδιαγραφές του προϊόντος ή να παραγγείλουν κύτταρα 3T6-Swiss albino απευθείας από το cytion.com.

Σημαντικές δημοσιεύσεις

1. Todaro GJ, Green H (1963) Ποσοτικές μελέτες της ανάπτυξης κυττάρων εμβρύου ποντικού σε καλλιέργεια και της εξέλιξής τους σε καθιερωμένες σειρές. The Journal of Cell Biology. PMID: 13985244
2. Lung O, Candlish R, Nebroski M, et al. (2021) Αλληλούχιση υψηλής απόδοσης για την ταυτοποίηση ειδών και την ανίχνευση μόλυνσης σε 63 κυτταρικές σειρές. Scientific Reports. PMID: 34737324
3. Hyde-DeRuyscher R, Carmichael GG (1988) Η εναλλαγή πρώιμου-όψιμου γονιδίου του πολυομαϊού δεν ρυθμίζεται στο επίπεδο της έναρξης της μεταγραφής και σχετίζεται με αλλαγές στην επεξεργασία του RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. PMID: 2848251
4. Rhee E, Carmichael GG (1989) Μεταφραστική αποδοτικότητα μορίων mRNA όψιμου τύπου του πολυοϊού που διαφέρουν ως προς τις αλληλουχίες των 5' μη κωδικοποιητικών εξονίων-οδηγών τους. Journal of Virology. PMID: 2535746
5. Chang D, Haynes JI 2nd, Brady JN, Consigli RA (1992) Ταυτοποίηση μιας αλληλουχίας πυρηνικής εντόπισης στην πρωτεΐνη καψιδίου VP2 του πολυομαϊού. Virology. PMID: 1333132
6. Bildin VN, Seregina TB, Zhestyanikov VD (1990) Επίδραση του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) και της ινσουλίνης στην κινητική της επιδιόρθωσης βλαβών του DNA που προκαλούνται από ακτινοβολία. Acta Biologica Hungarica. PMID: 2094129
7. Bil'din VN, Seregina TB, Zhestianikov VD (1992) Η ρύθμιση της διαδικασίας επιδιόρθωσης του DNA σε κύτταρα θηλαστικών. IV. Ο ρόλος των DNA πολυμερασών στη ρύθμιση, μέσω του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, της επιδιόρθωσης των θραύσεων μονόκλωνου DNA που προκαλούνται από ιονίζουσα ακτινοβολία σε κύτταρα ποντικού Swiss 3T6. Tsitologiia (στα ρωσικά· αγγλική περίληψη). PMID: 1295156
8. Tatibana M, Ishijima S, Kita K, et al. (1989) Πρόωρη μιτογενής διέγερση της μεταβολικής ροής μέσω του φωσφοριβοσυλ πυροφωσφορικού προς νουκλεοτίδια σε κύτταρα Swiss 3T3 και ανάγκη εξωτερικού μαγνησίου για την απόκριση. Advances in Enzyme Regulation. PMID: 2483026
9. Kleuser B, Adam G (1985) Αλληλεξάρτηση μεταξύ της περιεκτικότητας των κυττάρων σε rRNA και της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου φυσιολογικών και μετασχηματισμένων κυτταρικών σειρών ποντικού. Cell Biology International Reports. PMID: 3905022
10. Thayer MJ, Tapscott SJ, Davis RL, Wright WE, Lassar AB, Weintraub H (1989) Θετική αυτορύθμιση του γονιδίου μυογενούς καθορισμού MyoD1. Cell. PMID: 2546677
11. Chin SS, Liem RK (1989) Έκφραση των πρωτεϊνών νευροφιλαμεντών αρουραίου NF-L και NF-M σε μεταμοσχευμένα μη νευρωνικά κύτταρα. European Journal of Cell Biology. PMID: 2516804
12. Gonzalez FA, Bonapace E, Belzer I, Friedberg I, Heppel LA (1989) Δύο διακριτοί υποδοχείς για το ATP μπορούν να διακριθούν σε ινοβλάστες ποντικού Swiss 3T6 βάσει της απευαισθητοποίησής τους. Biochemical and Biophysical Research Communications. PMID: 2818584
13. Hou L, Gu W, Zhu H, et al. (2017) Το Spiroplasma eriocheiris προκαλεί απόπτωση σε αλμπίνο κύτταρα ποντικού 3T6-Swiss, η οποία σχετίζεται με τον μηχανισμό μόλυνσης. Molecular Immunology. PMID: 28889064
14. Hou L, Liu Y, Gao Q, et al. (2017) Η πρωτεΐνη τύπου προσκολλητικής πρωτεΐνης (ALP) του Spiroplasma eriocheiris αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες της περιοχής του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) για να διευκολύνει τη μόλυνση. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. PMID: 28184355
15. Zhu H, Liu P, Du J, et al. (2017) Ταυτοποίηση της πρωτεΐνης λυσοφωσφολιπάσης από το Spiroplasma eriocheiris και επαλήθευση της λειτουργίας της. Microbiology (Reading). PMID: 27926815
16. Rathinavel S, Korrapati PS, Kalaiselvi P, Dharmalingam S (2021) Νανοΐνες PCL/κουρκουμίνης με ενσωματωμένο μεσοπορώδες διοξείδιο του πυριτίου για εφαρμογή στην επούλωση τραυμάτων. European Journal of Pharmaceutical Sciences. PMID: 34571179
17. Nicolini C, Lanzi M, Accossato P, et al. (1995) Βιοαισθητήρας με βάση το πυρίτιο για δοκιμές τοξικότητας σε πραγματικό χρόνο σε φυσιολογικά έναντι καρκινικών ηπατικών κυττάρων. Βιοαισθητήρες και Βιοηλεκτρονική. PMID: 7576440