はじめに

その3T6-スイス・アルビノ細胞、別名Swiss 3T6、NIH 3T6、3T6、GM05862としても知られるこの細胞株は、生物医学研究において最も長く使用され続けている自然不死化マウス線維芽細胞株の一つである。 1963年にトダロとグリーンによって、分散処理されたスイス系マウス胚から樹立されたこの細胞株は、特定の継代条件下において、初代マウス胚細胞が自然不死化を起こし得ることを実証した最初の細胞株の一つである。[1]。その後数十年にわたり、研究者たちは3T6-Swissアルビノ細胞を、ウイルス学、DNA修復、ヌクレオチド代謝、受容体生物学、生体材料評価など、驚くほど幅広い分野で活用してきた。 この細胞株は、短い倍加時間、堅牢な増殖特性、線維芽細胞様形態を備えており、実験的に扱いやすいモデルとなっている。また、成長因子やマイトジェンに対する反応性が十分に解明されていることから、非形質転換および自然形質転換した線維芽細胞を背景としたシグナル伝達や細胞周期の制御を研究するための有力なツールとしても利用されている。

主なポイント

• 3T6-Swiss albinoは、1963年にトダロとグリーンによってスイスマウスの胚から樹立された、自然不死化マウス線維芽細胞株である。
• この細胞株は、Cellosaurusのアクセッション番号CVCL_0601を持ち、約15時間という極めて短い倍加時間を特徴としています。
• 「3T6」という名称は、この細胞株の樹立に使用された培養条件を表しています。すなわち、3日ごとに、6 × 10の接種量で継代を行うというものです。⁵ プレートあたりの細胞数。
• これはウイルス学の研究、特にポリオマウイルスの転写、複製、およびキャプシドタンパク質に関する研究において広く利用されてきた。
• この細胞株は、DNA修復メカニズム、成長因子シグナル伝達、およびヌクレオチド生合成を解明するための有力なモデルとして機能している。
• 3T6-Swissアルビノ細胞は細胞内細菌感染を受けやすいため、宿主と病原体の相互作用の研究に有用である。
• この細胞株は、生体材料および創傷治癒の研究において、生体適合性および細胞毒性試験の検証を受けています。

3T6-スイス・アルビノとは何ですか？

3T6-Swiss albino (CVCL_0601) は、スイス・アルビノマウスの胚全体組織から作製された。Cellosaurus では、この系統の性別は「雄」と記録されている。 創設培養物は、17～19日齢のスイス系マウス胚を混合して細かく刻むことで調製されたため、この系統は単一の特定されたドナー個体に遡るものではない。[1]. この細胞株は、トダロとグリーンが考案した画期的な「3Tプロトコル」によって樹立された。このプロトコルでは、マウス胚由来の初代細胞を、一定の期間と接種密度で連続的に継代し、自然不死化が起こるまで培養した。 この命名法は、その培養法を直接表している。「3T」は3日間隔での継代を意味し、2番目の数字は10の累乗単位での接種量を表している。⁵ プレートあたりの細胞数。したがって、3T6は6 × 10⁵ プレートあたりの細胞数、姉妹株である3T3（3 × 10⁵) および 3T12 (12 × 10⁵) 同じ研究で述べられている[1].

樹立時に用いられた培養条件が、その結果として現れる表現型を形作った。3T3は意図的に低密度に保たれ、細胞が密接に接する状態（コンフルエンス）に達することを決して許されなかったため、極めて強い接触抑制を示す株が得られたのに対し、高密度で維持された株は徐々に接触抑制を失い、多層構造を形成し、はるかに高い飽和密度に達した。[1]. したがって、細胞バンクでは、3T6を「接触抑制を受けない」と記述しており、これは3T3とは明確に異なる。 その研究における他の確立されたマウス系統と同様に、3T6も樹立過程で二倍体から異倍体へと核型が変化し、低四倍体の範囲に定着した。細胞バンクによると、核型は不安定であり、幹細胞株の染色体数は78～81本である。 この系統はコラーゲンとヒアルロン酸を産生し、線維芽細胞由来であることを反映する特定の結合組織特性を保持している。シトクロムcオキシダーゼサブユニット1（COX1）遺伝子を標的としたハイスループットシーケンシングにより種同定が確認されており、マウス由来であることを独立した分子レベルで裏付けている。[2].

細胞培養に関する情報

3T6-スイスアルビノ細胞の利点

3T6-スイスアルビノ細胞の最も実用的な利点の一つは、その急速な増殖速度である。 TodaroとGreenは、3T6細胞株が完全にヘテロプライド化した後、8回連続の継代を経て、その世代時間が29時間から15時間に短縮されたことを報告しており、同系統において14時間未満の値も記録されている。[1]. したがって、細胞バンクでは、倍加時間が約15時間と記載されている。これにより、ハイスループットな実験ワークフローが可能となり、アッセイに必要な十分な細胞数を確保するための時間を短縮できるほか、付着性単層の増殖パターンにより、顕微鏡による観察や操作が容易に行える。

3T6-Swissアルビノ細胞の幅広い実験的扱いやすさは、2つ目の大きな利点となっています。この細胞株は、さまざまな発現ベクターを用いた安定および一過性のトランスフェクションに対応しており、ポリオマウイルスの生産的な増殖にも利用されてきたほか、成長因子やプリン作動性アゴニストなどの細胞外刺激に対しても確実に反応します。 この汎用性により、1つの細胞株で1つの研究室内の複数の実験ニーズに対応できるため、多数の異なる細胞株を維持する負担を軽減できる。さらに、この細胞株は分子ウイルス学から生体材料の試験に至るまで、多岐にわたる分野で有用性が実証されており、その幅広い適用可能性を裏付けている。

3T6-スイスアルビノ細胞の限界

3T6-Swissアルビノ細胞は、樹立過程で接触抑制を失った自然不死化細胞株として、通常の線維芽細胞よりもはるかに高い飽和密度に達し、接触抑制を受けた培養に見られるような密度依存性の増殖停止は起こらない。[1]. したがって、この細胞株では、3T3などの細胞株で見られる接触抑制反応を再現することはできず、正常な組織の生理機能を再現することを目的とした実験を設計する際には、これが重要な考慮事項となり得る。腫瘍抑制、付着依存性増殖制御、あるいは正常な創傷治癒反応を研究している研究者は、この細胞株からの結果を解釈する際に注意を払う必要がある。 核型にも関連する制限がある。3T6は二倍体ではなくヘテロ倍体であり、低四倍体範囲の不安定な染色体構成を有するため、整倍体ゲノムを必要とする研究には適した背景株ではない。

もう一つの制限は、このモデルがマウス由来であり、胚由来かつ線維芽細胞性であるという点にある。3T6-Swissアルビノ細胞で得られた知見は、ヒトの細胞生物学や分化した細胞タイプに直接当てはまるとは限らない。すべての連続培養細胞株と同様に、長期にわたる継代により生じるゲノムドリフトが、表現型の変動をもたらす可能性がある。 したがって、種の同一性を確認し、経時的な交差汚染の可能性を検出するために、定期的な真正性確認を行うことが推奨される。 なお、ヒト細胞株のゴールドスタンダードであるショートタンデムリピート（STR）プロファイリングは、ここでは適用できません。非ヒト細胞株については、COX1遺伝子のDNAバーコーディングが確立された手法であり、3T6もまさにその手法によって真正性が確認されています。[2].

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応用分野

ウイルス学およびウイルス遺伝子発現

3T6-スイスアルビノ細胞は、数十年にわたりポリオマウイルス研究において生産的な宿主系として利用されてきた。Hyde-DeRuyscherとCarmichaelは、NIH 3T6細胞を用いて詳細な核内ランオンアッセイを実施し、生産的感染中のポリオマウイルス遺伝子発現の時間的制御を解析した[3]。 彼らの研究により、ポリオマウイルスの早期から後期への切り替えが、転写開始の段階では調節されていないことが実証された。その代わりに、この切り替えはRNA処理の変化に関連しており、この発見はマウス線維芽細胞におけるウイルス遺伝子調節の理解を根本的に形作った。

リーとカーマイケルは、NIH 3T6感染系を活用して、ポリオマウイルス後期mRNAの翻訳効率を調査した。彼らは、5'非コード後期リーダーエクソン配列のみが異なる2つのウイルス株で細胞を共感染させ、感染後期時点においてポリソームを単離した[4]。 彼らのポリソームプロファイリング実験により、レイトリーダーの配列が翻訳効率に影響を与えないことが実証され、ウイルスmRNAの利用に関する重要なメカニズムの知見が得られた。

これと相補的な研究として、Changらは2つの収束的戦略を用いて、ポリオマウイルスマイナーキャプシドタンパク質VP2のC末端領域に核局在シグナル（NLS）を同定した[5]。 遺伝学的「差分」アプローチでは、全長および切断された VP2 構築体を COS-7 細胞にトランスフェクトしたところ、Glu307～Leu318 の残基を除去すると VP2 が細胞質に局在することが示された。 生化学的な「加法」アプローチでは、NIH 3T6 細胞を用いた。その配列に対応する合成ペプチドをウシ血清アルブミンおよび免疫グロブリン G と架橋させ、 蛍光標識した後、3T6細胞の細胞質にマイクロインジェクションした。その結果、両方のコンジュゲートは核内に蓄積したが、コンジュゲート化されていないキャリアタンパク質は蓄積しなかった。したがって、細胞質へのマイクロインジェクションにおける3T6細胞の適性は、NLSの確立において極めて重要であった。

DNA修復と成長因子シグナル伝達

3T6-スイスアルビノ細胞は、電離放射線によって誘発されるDNA鎖切断の修復や、この過程を調節する成長因子の役割を調査するために広く用いられてきた。 Bildin、Seregina、およびZhestyanikovは、5～10 Gyの線量の電離放射線に曝露されたSwiss 3T6細胞における一本鎖切断（SSB）および二本鎖切断（DSB）の修復動態を調べた[6]。 彼らは、アルカリ性スクロース密度勾配遠心分離法と併せて、中性およびアルカリ性溶出法を用いて鎖切断を定量した。その結果、血清欠乏により修復率が急激に低下する一方、上皮成長因子（EGF）およびインスリンによる再刺激によって修復率が部分的に回復することが明らかになり、細胞増殖シグナル伝達と DNA 損傷修復能力との間に直接的な関連があることが立証された。

Bil'din、Seregina、およびZhestianikovによるその後の研究では、この成果をさらに発展させ、増殖中、休止中、および増殖因子刺激を受けたSwiss 3T6細胞における放射線誘発性SSB修復に関与する特定のDNAポリメラーゼを同定した [7]。 DNAポリメラーゼαおよびδの特異的阻害剤であるアフィディコリンと、DNAポリメラーゼβを阻害する2',3'-ジデオキシチミジン-5'-三リン酸を用いて、彼らは、増殖状態にかかわらず、SSB修復がアフィディコリンに対してより敏感であることを発見した。 アフィディコリンは、活発に増殖している細胞に比べ、休止期およびマイトジェン刺激を受けた細胞において、約 3 倍の効力で DNA の回復を阻害した。このことから、休止期細胞における修復を制限する段階には、アフィディコリンに感受性のあるポリメラーゼ（おそらく DNA ポリメラーゼα）が関与していることが示唆された。

ヌクレオチド代謝の分野では、Tatibanaらは、ホスホリボシルピロリン酸（PRPP）を経由したヌクレオチドへの代謝フラックスに対する、初期の細胞増殖刺激について研究を行った[8]。 主にスイス 3T3 細胞を用いて、EGF とインスリンの併用により PRPP を介したフラックスが約 2 倍に増強され、この反応には外部からのマグネシウムの流入が必要であることを示した。 休眠状態の Swiss 3T6 細胞をヒト胎児線維芽細胞と併せて調べたところ、血清曝露時に同等のヌクレオチド合成の刺激が認められ、3T6 細胞も実験シリーズに直接組み入れられ、細胞増殖刺激に対する初期反応として、プリンおよびピリミジンのデノボ生合成がどのように活性化されるかが明らかになった。

細胞周期の調節と分化

Kleuser と Adam による画期的な研究では、Swiss 3T3 細胞と 3T6 細胞を直接比較し、リボソーム RNA 含有量、細胞サイズ、および細胞周期への進入との関係を調査した [9]。 その結果、2つの細胞株の間に根本的な生物学的相違があることが明らかになった。すなわち、3T3細胞は細胞周期に再進入する前に、細胞内rRNA含有量がある閾値レベルに達している必要があったのに対し、3T6細胞はrRNAの著しい増加なしにDNA複製を開始した。 この違いは、3T6 の形質転換には、通常、細胞周期への進入を制御するサイズチェックポイントからの切り離しが関与していることの証拠であると解釈され、この細胞株の形質転換表現型に関するメカニズムの洞察をもたらした。

Thayerらは、筋形成決定遺伝子MyoD1のトランスフェクションにより、内因性MyoD1遺伝子の発現が活性化され、正の自己調節が起こることを実証した[10]。 主要な実験系は 10T1/2 細胞株であったが、内因性 MyoD1 mRNA に対するこの効果は Swiss 3T6 細胞でも再現された。注目すべきは、試験されたいくつかの線維芽細胞および脂肪芽細胞株の中で、この現象が観察されたのは Swiss 3T6 細胞のみであったことである。 この特異性により、3T6細胞株は筋形成転換研究において有益な許容性のある宿主となっている。同研究では、MyoD1とミオゲニンが正の自己調節ループに関与していることも示され、このメカニズムは『Cell』誌に掲載された筋分化決定の理解に寄与した。

Chin と Liem は、マウス L ^tk− 細胞と並行して Swiss 3T6 細胞を安定トランスフェクション宿主として用い、非神経細胞の環境におけるラット神経フィラメントタンパク質 NF-L および NF-M の発現を研究した [11]。 ニューロフィラメントのcDNAはSV40およびラウス肉腫ウイルスプロモーターによって発現が駆動され、ネオマイシン選択マーカーはSV40初期プロモーターによって駆動された。 NF-L および NF-M の両方の構築体で G418 耐性クローンが回収されたが、免疫蛍光法で検出可能な NF-M を発現するクローンしか樹立できなかった。免疫電子顕微鏡観察により、NF-M はビメンチンと同じ中間 filaments 上で共局在していることが示された。 これとは別に、Gonzalezらは、Swiss 3T6マウス線維芽細胞を用いて、カルシウム流出および細胞膜の透過化を制御する2つの異なるATP受容体媒介シグナル伝達経路を特徴づけ、これらの細胞に複数のプリン受容体が存在することと一致する、経路間の選択的な脱感作を実証した[12]。

宿主と病原体の相互作用

3T6-Swiss アルビノ細胞は、細胞内細菌病原体、特に Spiroplasma eriocheiris を研究するための有益な in vitro モデルであることが証明されている。 Houらは、免疫蛍光法および透過型電子顕微鏡観察により、S. eriocheirisが3T6細胞に侵入し、封入体を形成し、空胞化を誘導することを実証した[13]。フローサイトメトリーおよびMTTアッセイにより、この感染がアポトーシスを誘導し、細胞生存率を著しく低下させることが確認された。 感染性細菌は感染後わずか1時間で検出可能となり、12時間後には急激に増加した。感染した3T6細胞のmRNAおよびマイクロRNAの発現プロファイリングを併せて解析した結果、6時間後に619の差異発現転写産物と22の差異発現miRNAが同定され、これらは焦点接着およびMAPKシグナル伝達経路に集約していた。

この相互作用の分子メカニズムは、同じ細胞モデルにおいてさらに詳細に解明された。Houらは、S. eriocheirisの外膜上に接着因子様タンパク質（ALP）を同定し、これが3T6-Swissアルビノ細胞への感染に必須であることを示した[14]。酵母ツーハイブリッドスクリーニング、 ファーウェスタンブロッティング、および共局在実験により、ALPがマウスタンパク質フィブリン-7のEGFドメインに結合すること、また組換えALPがEGFとの競合を通じて3T6細胞におけるEGFRシグナル伝達経路の活性を抑制することが確立された。これは、細菌の表面タンパク質が宿主の成長因子軸を利用する顕著な例である。 これと補完的な研究において、ZhuらはS. eriocheirisのリゾホスホリパーゼを同定し、この微生物がマウスの3T6細胞に侵入して生存する能力を有することを指摘するとともに、抗体中和法によって、この酵素が感染初期の病原性に寄与することを示した[15]。 これらの研究を総合すると、3T6-スイスアルビノ細胞が、スピロプラズマ感染研究のための再現性の高い哺乳類モデルであることが確立された。

生体材料の評価およびバイオセンサーへの応用

3T6-Swiss アルビノ細胞は、その旺盛な増殖力と線維芽細胞様特性により、新規生体材料の生体適合性を評価するための有用なモデルとなっている。 Rathinavelらは、創傷治癒への応用を目的として、メソポーラスシリカ（SBA-15）、ポリカプロラクトン、およびクルクミンからなるエレクトロスピニング複合ナノスキャフォールドを評価した[16]。 細胞接着アッセイおよび生細胞／死細胞アッセイを用いて、スイス3T6細胞における細胞遊走、増殖、および生体適合性を評価し、抗菌性試験およびラットを用いた生体内創傷モデルを補完した。この研究は、創傷治癒用生体材料候補のスクリーニングプラットフォームとしての3T6-スイス・アルビノ細胞の実用的な有用性を浮き彫りにした。

材料試験以外にも、3T6-Swissアルビノ細胞は細胞ベースのバイオセンサー研究に活用されている。 Nicoliniらは、シリコンベースの電位差式交番バイオセンサー（PAB）— 光アドレス可能なpH感受性トランスデューサー構成 — を用いて、薬剤の毒性の指標として細胞外酸性化速度をリアルタイムでモニタリングした [17]。 著者らは、ミトキサントロン処理したラット初代肝細胞およびHepG2肝癌細胞に加え、DNA抗代謝剤であるシタラビン（Ara-C）処理後の3T6マウス線維芽細胞の酸性化速度の変化を記録し、センサーの測定値を従来の光学顕微鏡、 ニュートラルレッド、およびトリパンブルーアッセイと照合した。この細胞株は、代謝活性が予測可能であり、センサー基板上での培養が容易であるため、これらの実験に非常に適していた。総じて、これらの応用例は、3T6-Swissアルビノ細胞が、細胞生物学と材料科学を橋渡しするトランスレーショナル研究において有用な位置を占めていることを示している。

結論

3T6-Swissアルビノ細胞（CVCL_0601）は、極めて汎用性が高く、歴史的にも重要なマウス線維芽細胞株である。 1963年にTodaroとGreenによって、スイスマウスの胚から、1プレートあたり6 × 10⁵細胞の密度で3日間の移植法を用いて樹立されたこの細胞株は、ウイルス学、DNA修復、細胞周期生物学、筋分化、受容体シグナル伝達、宿主-病原体相互作用、および生体材料の評価に及ぶ広範な文献を蓄積してきた。 その短い倍加時間、生産的なウイルス感染を受けやすい性質、そして成長因子やマイトジェンに対する反応性により、この細胞株は扱いやすく、実験的に柔軟性の高いモデルシステムとなっています。 ポリオマウイルスの転写の研究、EGF によって調節される放射線誘発性 DNA 鎖切断の修復の調査、新規創傷治癒用スキャフォールドの生体適合性の評価、あるいは細胞内細菌の病原性の評価など、その目的が何であれ、3T6-Swiss アルビノ細胞は、十分に検証され、再現性の高い実験プラットフォームを提供します。 この細胞株を研究プログラムに組み込みたい研究者は、cytion.com で製品の完全な仕様を確認するか、3T6-Swiss アルビノ細胞を直接ご注文いただけます。

主な参考文献

1. Todaro GJ, Green H (1963) 培養下におけるマウス胚細胞の増殖および確立された細胞株への分化に関する定量的研究。The Journal of Cell Biology. PMID: 13985244
2. Lung O, Candlish R, Nebroski M, et al. (2021) 63の細胞株における種同定および汚染検出のためのハイスループットシーケンシング。Scientific Reports. PMID: 34737324
3. Hyde-DeRuyscher R, Carmichael GG (1988) ポリオマウイルスの早期-後期スイッチは転写開始の段階では調節されず、RNA処理の変化と関連している。『Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America』. PMID: 2848251
4. Rhee E, Carmichael GG (1989) 5'非コード後期リーダーエクソンの配列が異なるポリオマウイルス後期mRNA分子の翻訳効率。Journal of Virology. PMID: 2535746
5. Chang D、Haynes JI 2nd、Brady JN、Consigli RA (1992) ポリオマウイルスキャプシドタンパク質VP2における核局在配列の同定。『Virology』。PMID: 1333132
6. Bildin VN、Seregina TB、Zhestyanikov VD (1990) 放射線誘発性DNA損傷の修復動態に対する上皮成長因子（EGF）およびインスリンの影響。『Acta Biologica Hungarica』。PMID: 2094129
7. ビルディン VN、セレギナ TB、ジェスティアニコフ VD (1992) 哺乳類細胞におけるDNA修復プロセスの調節。 IV. Swiss 3T6マウス細胞において、電離放射線によって誘発された一本鎖DNA切断の修復に対する上皮成長因子の調節におけるDNAポリメラーゼの役割。Tsitologiia（ロシア語；英語要旨）。PMID: 1295156
8. Tatibana M、Ishijima S、Kita K、他（1989）スイス3T3細胞におけるホスホリボシルピロリン酸を介したヌクレオチドへの代謝フラックスの初期の細胞増殖刺激およびその反応に必要な外部からのマグネシウム。Advances in Enzyme Regulation。 PMID: 2483026
9. Kleuser B、Adam G（1985）正常および形質転換マウス細胞株における細胞内rRNA含有量と細胞周期の調節との相互関係。Cell Biology International Reports。PMID: 3905022
10. Thayer MJ、Tapscott SJ、Davis RL、Wright WE、Lassar AB、Weintraub H (1989) 筋形成決定遺伝子 MyoD1 の正の自己調節。『Cell』。PMID: 2546677
11. Chin SS, Liem RK (1989) トランスフェクトされた非神経細胞におけるラット神経フィラメントタンパク質NF-LおよびNF-Mの発現。European Journal of Cell Biology. PMID: 2516804
12. Gonzalez FA、Bonapace E、Belzer I、Friedberg I、Heppel LA (1989) Swiss 3T6マウス線維芽細胞において、脱感作の様式によって2つの異なるATP受容体を区別できる。Biochemical and Biophysical Research Communications. PMID: 2818584
13. Hou L、Gu W、Zhu H、他（2017）Spiroplasma eriocheirisは、感染メカニズムに関連してマウス3T6-Swissアルビノ細胞のアポトーシスを誘導する。『Molecular Immunology』。PMID: 28889064
14. Hou L、Liu Y、Gao Q、他（2017）Spiroplasma eriocheirisのアドヘシン様タンパク質（ALP）は、表皮成長因子（EGF）ドメインタンパク質と相互作用し、感染を促進する。『Frontiers in Cellular and Infection Microbiology』 PMID: 28184355
15. Zhu H、Liu P、Du J、他（2017）Spiroplasma eriocheiris由来のリゾホスホリパーゼタンパク質の同定とその機能の検証。『Microbiology (Reading)』。PMID: 27926815
16. Rathinavel S、Korrapati PS、Kalaiselvi P、Dharmalingam S（2021）創傷治癒用途に向けたメソポーラスシリカを組み込んだPCL/クルクミンナノファイバー。『European Journal of Pharmaceutical Sciences』。PMID: 34571179
17. Nicolini C、Lanzi M、Accossato P、他 (1995) 正常肝細胞とがん肝細胞におけるリアルタイム毒性試験のためのシリコン系バイオセンサー。Biosensors and Bioelectronics. PMID: 7576440