Inledning

Den 3T6-schweiziska albino-celler, även känd som Swiss 3T6, NIH 3T6, 3T6 och GM05862, utgör en av de mest långlivade spontant odödliggjorda musfibroblastcellinjerna inom biomedicinsk forskning. Denna cellinje, som etablerades 1963 av Todaro och Green från uppdelade Swiss-musembryon, var bland de första som visade att primära musembryoceller kunde genomgå spontan odödliggöring under definierade passageringsförhållanden [1]. Under de följande årtiondena har forskare använt 3T6-Swiss-albino-celler inom ett anmärkningsvärt brett spektrum av discipliner, däribland virologi, DNA-reparation, nukleotidmetabolism, receptorbiologi och utvärdering av biomaterial. Cellinjen har en snabb fördubblingstid, robusta tillväxtegenskaper och fibroblastisk morfologi, vilket gör den till en experimentellt hanterbar modell. Dess välkarakteriserade respons på tillväxtfaktorer och mitogener har också gjort den till ett populärt verktyg för att studera signaltransduktion och cellcykelreglering i icke-transformerade respektive spontant transformerade fibroblastmiljöer.

Viktiga slutsatser

• 3T6-Swiss albino är en spontant odödliggjord fibroblastcellinje från mus som etablerades 1963 av Todaro och Green utifrån embryon från Swiss-möss.
• Cellinjen har Cellosaurus-accessionsnumret CVCL_0601 och kännetecknas av en exceptionellt snabb fördubblingstid på cirka 15 timmar.
• Beteckningen ”3T6” anger det odlingsförfarande som använts för att framställa den: överföring var tredje dag med en inokulummängd på 6 × 10⁵ celler per platta.
• Den har använts i stor utsträckning inom virologiska studier, särskilt i forskning om transkription, replikation och kapsidproteiner hos polyomavirus.
• Denna cellinje utgör en pålitlig modell för att undersöka DNA-reparationsmekanismer, tillväxtfaktorsignalering och nukleotidbiosyntes.
• 3T6-celler från schweiziska albinoer är mottagliga för intracellulära bakterieinfektioner, vilket gör dem användbara för studier av interaktionen mellan värd och patogen.
• Cellinjen har validerats för tester av biokompatibilitet och cytotoxicitet inom forskning om biomaterial och sårläkning.

Vad är 3T6-Swiss albino?

3T6-Swiss albino (CVCL_0601) härstammar från vävnad från hela embryon hos Swiss albino-möss; enligt Cellosaurus är könet på denna stam han. Grundkulturerna framställdes genom att finfördela sammanslagna 17–19 dagar gamla embryon från schweiziska möss, vilket innebär att linjen inte kan spåras tillbaka till ett enda identifierat donatordjur. [1]. Cellinjen etablerades enligt det banbrytande 3T-protokollet som utarbetats av Todaro och Green, där primära musembryoceller odlades vidare i serie vid fasta intervall och inokulationsdensiteter tills spontan odödliggörande inträffade. Namnet återspeglar direkt denna metod: ”3T” står för överföring med tre dagars intervall, och det andra talet anger inokulumet i enheter om 10⁵ celler per platta. Följaktligen hölls 3T6-cellerna på 6 × 10⁵ celler per platta, tillsammans med systerlinjerna 3T3 (3 × 10⁵) och 3T12 (12 × 10⁵) som beskrivs i samma studie [1].

De odlingsförhållanden som användes under etableringen formade den resulterande fenotypen. Medan 3T3 medvetet hölls gles och aldrig tilläts nå konfluens – vilket resulterade i en cellinje med utpräglad kontaktinhibering – förlorade de celllinjer som odlades vid högre tätheter gradvis sin kontaktinhibering, bildade flera skikt och nådde betydligt högre mättnadstätheter [1]. Cellbankerna beskriver därför 3T6 som en cellinje som inte hämmas av kontakt, i tydlig kontrast till 3T3. Liksom alla etablerade musstammar i den studien övergick även 3T6 från en diploid till en heteroploid karyotyp under etableringen och stabiliserades i det hypotetraploida intervallet; stambanker rapporterar en instabil karyotyp med en stamlinje på 78–81 kromosomer. Linjen producerar kollagen och hyaluronsyra och behåller vissa bindvävsegenskaper som speglar dess fibroblastiska ursprung. Artidentiteten har bekräftats genom högkapacitetssekvensering riktad mot cytokrom c-oxidas-subenhet 1-genen (COX1), vilket ger en oberoende molekylär verifiering av det murina ursprunget [2].

Information om cellodling

Fördelar med 3T6-Swiss-albino-celler

En av de mest praktiska fördelarna med 3T6-Swiss-albino-celler är deras snabba tillväxthastighet. Todaro och Green dokumenterade hur generationstiden för den framväxande 3T6-linjen sjönk från 29 timmar till 15 timmar under åtta på varandra följande överföringar efter att populationen hade blivit helt heteroploid, och värden under 14 timmar registrerades i samma linje [1]. Cellbanker anger därför en fördubblingstid på cirka 15 timmar. Detta underlättar experimentella arbetsflöden med hög genomströmning och minskar den tid som krävs för att generera tillräckligt många celler för analyser, samtidigt som det vidhäftande monolagret underlättar enkel mikroskopisk observation och hantering.

Den stora experimentella användbarheten hos 3T6-Swiss-albino-celler utgör en andra stor fördel. Cellinjen möjliggör både stabil och transient transfektion med en rad olika expressionskonstruktioner, har använts för produktiv odling av polyomavirus och reagerar pålitligt på extracellulära stimuli såsom tillväxtfaktorer och purinerga agonister. Denna mångsidighet innebär att en enda cellinje kan tillgodose flera experimentella behov inom ett och samma laboratorium, vilket minskar bördan av att underhålla ett stort antal olika cellbanker. Dessutom har cellinjen visat sig vara användbar inom ett brett spektrum av discipliner – från molekylär virologi till testning av biomaterial – vilket understryker dess breda tillämpbarhet.

Begränsningar hos 3T6-Swiss-albino-celler

Som en spontant odödliggjord cellinje som förlorade kontaktinhibitionen under etableringen uppnår 3T6-Swiss-albino-cellerna betydligt högre mättnadsdensiteter än normala fibroblaster och uppvisar inte den densitetsberoende tillväxtstopp som kännetecknar kontaktinhiberade odlingar [1]. De återspeglar därför inte de kontakthämmande reaktioner som observeras i cellinjer som 3T3, vilket kan vara en avgörande faktor vid utformningen av experiment som syftar till att återspegla normal vävnadsfysiologi. Forskare som undersöker tumörsuppression, förankringsberoende tillväxtkontroll eller normala sårläkningsreaktioner bör iaktta försiktighet vid tolkningen av resultat från denna cellinje. Karyotypen utgör en relaterad begränsning: 3T6 är heteroploid snarare än diploid, med ett instabilt kromosomkomplement i det hypotetraploida intervallet, och är därför inte en lämplig bakgrund för arbete som kräver ett euploida genom.

En ytterligare begränsning gäller modellens ursprung från möss, dess embryonala karaktär och dess fibroblastiska natur. Resultat som erhållits i 3T6-Swiss-albino-celler kan eventuellt inte direkt överföras till mänsklig cellbiologi eller till differentierade celltyper. Liksom för alla kontinuerliga cellinjer kan genomisk drift vid ett stort antal passager leda till fenotypisk variation. Regelbunden autentisering rekommenderas därför för att bekräfta artidentiteten och upptäcka eventuella fall av korskontaminering över tid. Observera att STR-profilering (short tandem repeat), som är guldstandarden för humana cellinjer, inte är tillämplig här; för icke-humana cellinjer är DNA-streckkodning av COX1-genen den etablerade metoden, och 3T6 har autentiserats med just den metoden [2].

Se fullständiga specifikationer och beställ

Tillämpningar

Virologi och viral genuttryck

3T6-Swiss-albino-celler har under flera decennier fungerat som ett produktivt värdsystem för forskning om polyomavirus. Hyde-DeRuyscher och Carmichael använde NIH 3T6-celler för att genomföra detaljerade nukleära run-on-analyser och analysera den tidsmässiga regleringen av polyomavirusets genuttryck under en produktiv infektion [3]. Deras arbete visade att övergången från polyomavirusets tidiga till sena fas inte reglerades på transkriptionsinitieringsnivå. Istället var övergången förknippad med förändringar i RNA-bearbetningen, ett fynd som på ett grundläggande sätt formade förståelsen av viral genreglering i musfibroblaster.

Rhee och Carmichael utnyttjade infektionssystemet med NIH 3T6-celler för att undersöka translationseffektiviteten hos sena mRNA-molekyler från polyomavirus. De infekterade celler samtidigt med två virusstammar som endast skilde sig åt i sina 5'-icke-kodande exonsekvenser i den sena ledaren och isolerade polysomer vid sena tidpunkter under infektionen [4]. Deras experiment med polysomprofilering visade att sekvensen hos den sena ledaren inte påverkade translationseffektiviteten, vilket gav en viktig mekanistisk insikt i användningen av viralt mRNA.

I en kompletterande studie identifierade Chang och kollegor en nukleär lokaliseringssignal (NLS) i den C-terminala regionen av polyomavirusets mindre kapsidprotein VP2 med hjälp av två konvergerande strategier [5]. I den genetiska ”subtraktiva” metoden transfekterades VP2-konstruktioner i full längd och i trunkerad form till COS-7-celler, vilket visade att borttagandet av aminosyrorna Glu307–Leu318 begränsade VP2 till cytoplasman. Den biokemiska ”additiva” metoden baserades på NIH 3T6-celler: en syntetisk peptid som motsvarade den sekvensen tvärbindades till bovint serumalbumin och immunoglobulin G, märktes med fluorescens och mikroinjicerades i cytoplasman hos 3T6-celler, där båda konjugaten ackumulerades i cellkärnan medan de okonjugerade bärarproteinerna inte gjorde det. Att 3T6-celler var lämpliga för cytoplasmisk mikroinjektion var således avgörande för att fastställa NLS.

DNA-reparation och tillväxtfaktorsignalering

3T6-Swiss-albino-celler har använts i stor utsträckning för att undersöka reparationen av DNA-strängbrott orsakade av joniserande strålning och tillväxtfaktorernas roll i moduleringen av denna process. Bildin, Seregina och Zhestyanikov undersökte kinetiken för reparation av enkelsträngsbrott (SSB) och dubbelsträngsbrott (DSB) i Swiss 3T6-celler som exponerats för joniserande strålning i doser på 5–10 Gy [6]. De använde neutral och alkalisk eluering tillsammans med alkalisk sackarosgradientcentrifugering för att kvantifiera strängbrott. Deras resultat visade att serumdeprivation kraftigt minskade reparationshastigheterna, medan återstimulering med epidermal tillväxtfaktor (EGF) och insulin delvis återställde dem, vilket fastställde ett direkt samband mellan mitogen signalering och förmågan att reparera DNA-skador.

En efterföljande studie av Bil’din, Seregina och Zhestianikov utvidgade detta arbete genom att karakterisera de specifika DNA-polymeraserna som är involverade i strålningsinducerad SSB-reparation i prolifererande, vilande och mitogenstimulerade Swiss 3T6-celler [7]. Genom att använda aphidicolin, en specifik hämmare av DNA-polymeraserna alfa och delta, samt 2',3'-dideoxitymidin-5'-trifosfat för att hämma DNA-polymeras beta, fann de att SSB-reparationen var mer känslig för aphidicolin oavsett cellernas proliferativa tillstånd. Aphidicolin hämmade DNA-återställningen ungefär tre gånger så kraftigt i vilande och mitogenstimulerade celler som i aktivt prolifererande celler, vilket pekar på ett aphidicolinkänsligt polymeras – troligen DNA-polymeras alfa – som det steg som begränsar reparationen i vilande celler.

Inom området nukleotidmetabolism studerade Tatibana och kollegor tidig mitogen stimulering av det metaboliska flödet genom fosforibosylpyrofosfat (PRPP) till nukleotider [8]. De arbetade främst med Swiss 3T3-celler och visade att EGF i kombination med insulin förstärkte flödet genom PRPP ungefär två gånger och att tillförsel av externt magnesium krävdes för responsen. Vilande Swiss 3T6-celler undersöktes tillsammans med humana fetala fibroblaster och visade en jämförbar stimulering av nukleotidsyntesen vid exponering för serum, vilket placerade 3T6 direkt i den experimentella serien och illustrerade hur de novo-biosyntesen av purin och pyrimidin aktiveras som en tidig respons på mitogen stimulering.

Reglering av cellcykeln och differentiering

En banbrytande studie av Kleuser och Adam jämförde direkt Swiss 3T3- och 3T6-celler för att undersöka sambandet mellan innehållet av ribosomalt RNA, cellstorlek och inträde i cellcykeln [9]. Deras resultat avslöjade en grundläggande biologisk skillnad mellan de två cellinjerna: 3T3-celler krävde en tröskelnivå av cellulärt rRNA-innehåll innan de återinträdde i cellcykeln, medan 3T6-celler inledde DNA-replikation utan någon väsentlig ökning av rRNA. Denna skillnad tolkades som bevis för att 3T6-transformationen innebar en avkoppling från den storlekskontrollpunkt som normalt styr inträdet i cellcykeln, vilket gav en mekanistisk inblick i den transformerade fenotypen hos denna cellinje.

Thayer och kollegor visade att transfektion av det myogena determineringsgenet MyoD1 aktiverar uttrycket av det endogena MyoD1-genet, vilket indikerar positiv autoreglering [10]. Det primära experimentella systemet var 10T1/2-linjen, men effekten på endogent MyoD1-mRNA kunde reproduceras i Swiss 3T6-celler – anmärkningsvärt nog den enda ytterligare linjen bland flera testade fibroblast- och adipoblastlinjer där detta observerades. Denna specificitet gör 3T6 till en informativ, tillåtande bakgrund för studier av myogen omvandling. Samma arbete visade att MyoD1 och myogenin deltar i en positiv autoregulatorisk slinga, ett mekanistiskt bidrag till förståelsen av myogen differentiering som publicerades i Cell.

Chin och Liem använde Swiss 3T6-celler, parallellt med L tk−-celler från mus, som en stabil transfektionsvärd för att studera uttrycket av råttans neurofilamentproteiner NF-L och NF-M i ett icke-neuronalt cellulärt sammanhang [11]. Neurofilament-cDNA:na styrdes av SV40- och Rous sarkomvirus-promotorer, medan en tidig SV40-promotor styrde den neomycinbaserade selektionsmarkören. G418-resistenta kloner återfanns med både NF-L- och NF-M-konstruktionerna, men endast kloner som uttryckte immunofluorescensdetekterbart NF-M kunde etableras; immunoelektronmikroskopi visade att NF-M kolokaliserades med vimentin på samma intermediära filament. I ett separat arbete använde Gonzalez och kollegor Swiss 3T6-musfibroblaster för att karakterisera två distinkta ATP-receptor-medierade signalvägar som styr kalciumutflöde och permeabilisering av plasmamembranet, vilket visade på selektiv desensibilisering mellan signalvägarna – något som stämmer överens med förekomsten av flera purinoceptorer i dessa celler [12].

Interaktioner mellan värd och patogen

3T6-Swiss-albino-celler har visat sig vara en produktiv in vitro-modell för att studera intracellulära bakteriella patogener, särskilt Spiroplasma eriocheiris. Hou och kollegor visade att S. eriocheiris kunde invadera 3T6-celler, bilda inklusionskroppar och inducera vakuolisering, vilket visualiserades med hjälp av immunofluorescens och transmissionselektronmikroskopi [13]. Flödescytometri och MTT-analyser bekräftade att infektionen inducerade apoptos och signifikant minskade cellernas livskraft. Infektiösa bakterier kunde påvisas redan en timme efter infektion och ökade kraftigt efter 12 timmar. En jämförande profilering av mRNA- och mikroRNA-uttryck i infekterade 3T6-celler identifierade 619 transkript med differentierat uttryck och 22 miRNA med differentierat uttryck efter sex timmar, vilka konvergerade mot signalvägarna för fokala adhesioner och MAPK.

De molekylära mekanismerna bakom denna interaktion har analyserats ytterligare i samma cellmodell. Hou och kollegor identifierade ett adhesinliknande protein (ALP) på S. eriocheiris yttre membran och visade att det är nödvändigt för infektion av 3T6-Swiss-albino-celler [14]. Screening med jäst-tvåhybridmetoden, far-western-blotting och kolokaliseringsexperiment visade att ALP binder till EGF-domänen hos musproteinet fibulin-7, och att rekombinant ALP hämmar aktiviteten i EGFR-signalvägen i 3T6-celler genom att konkurrera med EGF – ett slående exempel på ett bakteriellt ytprotein som utnyttjar en värdens tillväxtfaktoraxel. I en kompletterande studie karakteriserade Zhu och kollegor ett lysofosfolipas från S. eriocheiris, där de noterade organismens förmåga att invadera och överleva i 3T6-celler från mus, och visade genom antikroppsneutralisering att enzymet bidrar till virulensen under den tidiga infektionsfasen [15]. Sammantaget etablerar dessa studier 3T6-Swiss-albino-celler som en reproducerbar däggdjursmodell för forskning om Spiroplasma-infektioner.

Utvärdering av biomaterial och tillämpningar inom biosensorer

Den kraftiga tillväxten och de fibroblastiska egenskaperna hos 3T6-Swiss-albino-celler har gjort dem till en användbar modell för utvärdering av biokompatibiliteten hos nya biomaterial. Rathinavel och kollegor utvärderade elektrospunna komposit-nanoscaffolds bestående av mesoporös kiseldioxid (SBA-15), polykaprolakton och kurkumin för sårläkningsapplikationer [16]. Cellmigrering, proliferation och biokompatibilitet utvärderades i Swiss 3T6-celler med hjälp av celladhesions- och levande/döda-analyser, vilket kompletterade antibakteriella tester och en in vivo-sårmodell på råttor. Studien belyste den praktiska nyttan av 3T6-Swiss-albino-celler som en screeningplattform för biomaterialkandidater inom sårläkning.

Utöver materialtestning har 3T6-Swiss-albino-celler använts i cellbaserad biosensorforskning. Nicolini och kollegor använde en kiselbaserad potentiometrisk alternerande biosensor (PAB) – en ljusadresserbar, pH-känslig givarkonfiguration – för att övervaka extracellulära försuringshastigheter i realtid som ett mått på läkemedelstoxicitet [17]. Förutom primära hepatocyter från råtta och HepG2-hepatomceller som behandlats med mitoxantron registrerade författarna förändringar i försuringshastigheten hos 3T6-musfibroblaster efter behandling med DNA-antimetaboliten cytarabin (Ara-C) och jämförde sensoravläsningarna med konventionell optisk mikroskopi, Neutral Red- och Trypan Blue-analyser. Cellinjen var väl lämpad för dessa experiment tack vare sin förutsägbara metaboliska aktivitet och att den är lätt att odla på sensorsubstrat. Sammantaget visar dessa tillämpningar att 3T6-Swiss-albino-celler fyller en användbar nisch inom translationell forskning som förbinder cellbiologi och materialvetenskap.

Slutsats

3T6-Swiss-albino-celler (CVCL_0601) utgör en anmärkningsvärt mångsidig och historiskt betydelsefull musfibroblastcellinje. Cellinjen etablerades ursprungligen från schweiziska musembryon av Todaro och Green 1963 enligt ett tre dagars överföringsschema med 6 × 10⁵ celler per platta, och har sedan dess genererat en omfattande litteratur som spänner över virologi, DNA-reparation, cellcykelbiologi, myogen differentiering, receptorsignalering, interaktioner mellan värd och patogen samt utvärdering av biomaterial. Dess snabba fördubblingstid, mottaglighet för produktiv virusinfektion och respons på tillväxtfaktorer och mitogener gör den till ett hanterbart och experimentellt flexibelt modellsystem. Oavsett om syftet är att studera transkription av polyomavirus, undersöka EGF-reglerad reparation av strålningsinducerade DNA-strängbrott, utvärdera biokompatibiliteten hos nya sårläkningsstödstrukturer eller bedöma intracellulär bakteriell patogenes, erbjuder 3T6-Swiss albino-celler en väl validerad och reproducerbar experimentell plattform. Forskare som vill använda denna cellinje i sina projekt kan ta del av de fullständiga produktspecifikationerna eller beställa 3T6-Swiss albino-celler direkt på cytion.com.

Viktiga publikationer

1. Todaro GJ, Green H (1963) Kvantitativa studier av tillväxten hos musembryoceller i odling och deras utveckling till etablerade cellinjer. The Journal of Cell Biology. PMID: 13985244
2. Lung O, Candlish R, Nebroski M, et al. (2021) Högkapacitetssekvensering för artidentifiering och detektering av kontaminering hos 63 cellinjer. Scientific Reports. PMID: 34737324
3. Hyde-DeRuyscher R, Carmichael GG (1988) Polyomavirusets övergång från tidiga till sena mRNA-molekyler regleras inte på transkriptionsinitieringsnivå och är förknippad med förändringar i RNA-bearbetningen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. PMID: 2848251
4. Rhee E, Carmichael GG (1989) Translationseffektivitet hos sena mRNA-molekyler från polyomavirus som skiljer sig åt i sekvenserna hos sina 5'-icke-kodande sena ledarexoner. Journal of Virology. PMID: 2535746
5. Chang D, Haynes JI 2nd, Brady JN, Consigli RA (1992) Identifiering av en nukleär lokaliseringssekvens i polyomavirusets kapsidprotein VP2. Virology. PMID: 1333132
6. Bildin VN, Seregina TB, Zhestyanikov VD (1990) Effekten av epidermal tillväxtfaktor (EGF) och insulin på kinetiken vid reparation av strålningsinducerade DNA-skador. Acta Biologica Hungarica. PMID: 2094129
7. Bil'din VN, Seregina TB, Zhestianikov VD (1992) Regleringen av DNA-reparationsprocessen i däggdjursceller. IV. DNA-polymerasernas roll i epidermal tillväxtfaktors reglering av reparationen av enkelsträngade DNA-brott inducerade av joniserande strålning i Swiss 3T6-musceller. Tsitologiia (på ryska; engelsk sammanfattning). PMID: 1295156
8. Tatibana M, Ishijima S, Kita K, et al. (1989) Tidig mitogen stimulering av det metaboliska flödet genom fosforibosylpyrofosfat till nukleotider i Swiss 3T3-celler och behovet av externt magnesium för responsen. Advances in Enzyme Regulation. PMID: 2483026
9. Kleuser B, Adam G (1985) Sambandet mellan cellulärt rRNA-innehåll och reglering av cellcykeln hos normala och transformerade muscellinjer. Cell Biology International Reports. PMID: 3905022
10. Thayer MJ, Tapscott SJ, Davis RL, Wright WE, Lassar AB, Weintraub H (1989) Positiv autoreglering av det myogena determineringsgenet MyoD1. Cell. PMID: 2546677
11. Chin SS, Liem RK (1989) Expression av råttans neurofilamentproteiner NF-L och NF-M i transfekterade icke-neuronala celler. European Journal of Cell Biology. PMID: 2516804
12. Gonzalez FA, Bonapace E, Belzer I, Friedberg I, Heppel LA (1989) Två distinkta receptorer för ATP kan särskiljas i Swiss 3T6-musfibroblaster utifrån deras desensibilisering. Biochemical and Biophysical Research Communications. PMID: 2818584
13. Hou L, Gu W, Zhu H, m.fl. (2017) Spiroplasma eriocheiris inducerar apoptos i 3T6-Swiss-albino-celler från mus, vilket är associerat med infektionsmekanismen. Molecular Immunology. PMID: 28889064
14. Hou L, Liu Y, Gao Q, et al. (2017) Spiroplasma eriocheiris-adhesinliknande protein (ALP) interagerar med proteiner med epidermal tillväxtfaktordomän (EGF) för att underlätta infektionen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. PMID: 28184355
15. Zhu H, Liu P, Du J, et al. (2017) Identifiering av lysofosfolipasprotein från Spiroplasma eriocheiris och verifiering av dess funktion. Microbiology (Reading). PMID: 27926815
16. Rathinavel S, Korrapati PS, Kalaiselvi P, Dharmalingam S (2021) Mesoporös kiseldioxid inkorporerad i PCL/kurkumin-nanofiber för sårläkningsapplikationer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. PMID: 34571179
17. Nicolini C, Lanzi M, Accossato P, et al. (1995) En kiselbaserad biosensor för realtidstestning av toxicitet i normala leverceller jämfört med cancerceller. Biosensors and Bioelectronics. PMID: 7576440