Introdução

O Células 3T6-Swiss albinas, também conhecida como Swiss 3T6, NIH 3T6, 3T6 e GM05862, representa uma das linhas celulares de fibroblastos de camundongo imortalizadas espontaneamente mais duradouras na pesquisa biomédica. Criada em 1963 por Todaro e Green a partir de embriões de camundongo suíço desagregados, essa linhagem foi uma das primeiras a demonstrar que células embrionárias primárias de camundongo podiam sofrer imortalização espontânea sob condições definidas de passagem [1]. Nas décadas seguintes, pesquisadores utilizaram as células albinas 3T6-Swiss em uma gama notavelmente ampla de disciplinas, incluindo virologia, reparo do DNA, metabolismo de nucleotídeos, biologia de receptores e avaliação de biomateriais. O rápido tempo de duplicação da linhagem celular, suas características de crescimento robustas e sua morfologia fibroblástica tornam-na um modelo experimentalmente maleável. Sua capacidade de resposta bem caracterizada a fatores de crescimento e mitógenos também a tornou uma ferramenta preferida para o estudo da transdução de sinais e da regulação do ciclo celular em contextos de fibroblastos não transformados em comparação com aqueles transformados espontaneamente.

Pontos principais

• A 3T6-Swiss albino é uma linhagem celular de fibroblastos de camundongo imortalizada espontaneamente, estabelecida em 1963 a partir de embriões de camundongo suíço por Todaro e Green.
• A linha celular possui o número de acesso CVCL_0601 no banco Cellosaurus e apresenta um tempo de duplicação excepcionalmente rápido, de aproximadamente 15 horas.
• A designação “3T6” indica o regime de cultura utilizado para obtê-la: transferência a cada 3 dias com um inóculo de 6 × 10⁵ células por placa.
• Tem sido amplamente utilizado em estudos de virologia, especialmente na pesquisa sobre a transcrição, a replicação e as proteínas da cápside do poliomavírus.
• Essa linhagem serve como um modelo robusto para a investigação dos mecanismos de reparo do DNA, da sinalização dos fatores de crescimento e da biossíntese de nucleotídeos.
• As células albinas suíças 3T6 são suscetíveis à infecção bacteriana intracelular, o que as torna úteis para estudos sobre a interação hospedeiro-patógeno.
• A linhagem foi validada para ensaios de biocompatibilidade e citotoxicidade em pesquisas sobre biomateriais e cicatrização de feridas.

O que é o 3T6-Swiss albino?

A linhagem 3T6-Swiss albino (CVCL_0601) foi derivada de tecido embrionário inteiro de camundongos Swiss albino; o Cellosaurus registra o sexo da linhagem como masculino. As culturas iniciais foram preparadas por meio da trituração de embriões agrupados de camundongos suíços com idades entre 17 e 19 dias, de modo que a linhagem não remonta a um único animal doador identificado [1]. A linha celular foi estabelecida por meio do protocolo 3T, pioneiro, desenvolvido por Todaro e Green, no qual células embrionárias primárias de camundongo foram submetidas a passagens seriadas em intervalos e densidades de inoculação fixos até que ocorresse a imortalização espontânea. A nomenclatura reflete diretamente esse regime: “3T” denota transferência em intervalos de três dias, e o segundo número denota o inóculo em unidades de 10⁵ células por placa. Assim, a linha 3T6 foi mantida a 6 × 10⁵ células por placa, juntamente com as linhagens irmãs 3T3 (3 × 10⁵) e 3T12 (12 × 10⁵) descrito no mesmo estudo [1].

As condições de cultura utilizadas durante o estabelecimento moldaram o fenótipo resultante. Enquanto a linha 3T3 foi deliberadamente mantida em baixa densidade e nunca se permitiu que atingisse a confluência — produzindo uma linha que apresenta inibição de contato extremamente acentuada —, as linhas mantidas em densidades mais elevadas perderam progressivamente a inibição de contato, formaram multicamadas e atingiram densidades de saturação muito mais elevadas [1]. Os bancos de células, portanto, descrevem a linhagem 3T6 como não inibida por contato, em contraste explícito com a linhagem 3T3. Assim como todas as linhagens de camundongo estabelecidas nesse estudo, a 3T6 também passou de um cariótipo diplóide para um heteroplóide durante o estabelecimento, estabilizando-se na faixa hipotetraplóide; os repositórios relatam um cariótipo instável com uma linhagem-tronco de 78 a 81 cromossomos. A linhagem produz colágeno e ácido hialurônico, mantendo certas características do tecido conjuntivo que refletem sua origem fibroblástica. A identidade da espécie foi confirmada por sequenciamento de alto rendimento direcionado ao gene da subunidade 1 da citocromo c oxidase (COX1), fornecendo autenticação molecular independente da origem murina [2].

Informações sobre cultura celular

Vantagens das células albinas 3T6-Swiss

Uma das vantagens mais práticas das células 3T6-Swiss albinas é sua rápida taxa de proliferação. Todaro e Green documentaram como o tempo de geração da linhagem 3T6 emergente caiu de 29 horas para 15 horas ao longo de oito transferências sucessivas, após a população ter se tornado totalmente heteroplóide, com valores inferiores a 14 horas registrados na mesma linhagem [1]. Assim, os bancos de células indicam um tempo de duplicação de aproximadamente 15 horas. Isso viabiliza fluxos de trabalho experimentais de alto rendimento e reduz o tempo necessário para gerar um número suficiente de células para os ensaios, enquanto o padrão de crescimento em monocamada aderente facilita a observação microscópica e a manipulação.

A ampla facilidade de manuseio experimental das células albinas 3T6-Swiss constitui uma segunda grande vantagem. A linhagem permite a transfecção estável e transitória com uma variedade de construções de expressão, tem sido utilizada para a propagação produtiva de poliomavírus e responde de forma confiável a estímulos extracelulares, como fatores de crescimento e agonistas purinérgicos. Essa versatilidade significa que uma única linhagem celular pode atender a múltiplas necessidades experimentais dentro de um mesmo laboratório, reduzindo a carga de manter inúmeros estoques celulares distintos. Além disso, a linhagem demonstrou utilidade em um amplo espectro de disciplinas — da virologia molecular aos testes de biomateriais —, ressaltando sua ampla aplicabilidade.

Limitações das células 3T6-Swiss albinas

Por se tratar de uma linhagem imortalizada espontaneamente que perdeu a inibição por contato durante o estabelecimento, as células albinas 3T6-Swiss atingem densidades de saturação muito mais elevadas do que os fibroblastos normais e não apresentam a parada de crescimento dependente da densidade observada em culturas com inibição por contato [1]. Portanto, elas não reproduzem as respostas de inibição de contato observadas em linhagens como a 3T3, o que pode ser uma consideração crítica ao planejar experimentos destinados a reproduzir a fisiologia do tecido normal. Pesquisadores que estudam a supressão tumoral, o controle do crescimento dependente de ancoragem ou as respostas normais de cicatrização de feridas devem ter cautela ao interpretar os resultados dessa linhagem. O cariótipo é uma limitação relacionada: a 3T6 é heteroplóide, e não diplóide, com um complemento cromossômico instável na faixa hipotetraplóide; portanto, não é uma base adequada para trabalhos que exijam um genoma euploide.

Uma limitação adicional está relacionada à natureza murina, embrionária e fibroblástica do modelo. Os resultados obtidos em células 3T6-Swiss albinas podem não ser diretamente aplicáveis à biologia celular humana ou a tipos de células diferenciadas. Assim como ocorre com todas as linhagens celulares contínuas, a deriva genômica ao longo de um número elevado de passagens pode introduzir variabilidade fenotípica. Recomenda-se, portanto, a autenticação regular para confirmar a identidade da espécie e detectar possíveis eventos de contaminação cruzada ao longo do tempo. Observe que o perfil de repetições em tandem curtas (STR), o padrão-ouro para linhagens humanas, não é aplicável neste caso; para linhagens celulares não humanas, o código de barras de DNA do gene COX1 é a abordagem estabelecida, e a linhagem 3T6 foi autenticada exatamente por esse método [2].

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Aplicações

Virologia e expressão gênica viral

As células 3T6-Swiss albino têm servido como um sistema hospedeiro produtivo para pesquisas com poliomavírus há várias décadas. Hyde-DeRuyscher e Carmichael utilizaram células NIH 3T6 para realizar ensaios detalhados de run-on nuclear e analisar a regulação temporal da expressão gênica do poliomavírus durante a infecção produtiva [3]. Seu trabalho demonstrou que a transição da fase precoce para a tardia do poliomavírus não era regulada no nível da iniciação da transcrição. Em vez disso, a transição estava associada a alterações no processamento do RNA, uma descoberta que moldou fundamentalmente a compreensão da regulação gênica viral em fibroblastos de camundongo.

Rhee e Carmichael utilizaram o sistema de infecção NIH 3T6 para investigar as eficiências de tradução dos mRNAs tardios do poliomavírus. Eles coinfecaram células com duas cepas virais que diferiam apenas em suas sequências 5' não codificantes do exão líder tardio e isolaram polissomos em momentos tardios da infecção [4]. Seus experimentos de perfilagem de polissomos demonstraram que a sequência do líder tardio não influenciava a eficiência de tradução, fornecendo uma importante compreensão mecanicista sobre a utilização do mRNA viral.

Em um estudo complementar, Chang e colegas identificaram um sinal de localização nuclear (NLS) na região C-terminal da proteína VP2 da cápside menor do poliomavírus, utilizando duas estratégias convergentes [5]. Na abordagem genética “subtrativa”, construções da VP2 de comprimento total e truncadas foram transfectadas em células COS-7, mostrando que a remoção dos resíduos Glu307–Leu318 confinou a VP2 ao citoplasma. A abordagem bioquímica “aditiva” utilizou células NIH 3T6: um peptídeo sintético correspondente a essa sequência foi reticulado com albumina sérica bovina e imunoglobulina G, marcado com fluorescência e microinjetado no citoplasma das células 3T6, onde ambos os conjugados se acumularam no núcleo, ao passo que as proteínas transportadoras não conjugadas não o fizeram. A adequação das células 3T6 para a microinjeção citoplasmática foi, portanto, fundamental para o estabelecimento do NLS.

Reparo do DNA e sinalização de fatores de crescimento

As células 3T6-Swiss albino têm sido amplamente utilizadas para investigar o reparo de quebras na fita de DNA induzidas por radiação ionizante e o papel dos fatores de crescimento na modulação desse processo. Bildin, Seregina e Zhestyanikov examinaram a cinética do reparo de quebras de fita simples (SSB) e de quebras de fita dupla (DSB) em células 3T6 suíças expostas à radiação ionizante em doses de 5–10 Gy [6]. Eles utilizaram eluição neutra e alcalina, juntamente com centrifugação em gradiente alcalino de sacarose, para quantificar as quebras de fita. Suas descobertas revelaram que a privação de soro reduziu drasticamente as taxas de reparo, enquanto a reestimulação com fator de crescimento epidérmico (EGF) e insulina as restaurou parcialmente, estabelecendo uma ligação direta entre a sinalização mitogênica e a capacidade de reparo de danos no DNA.

Um estudo subsequente realizado por Bil'din, Seregina e Zhestianikov ampliou esse trabalho ao caracterizar as polimerases de DNA específicas envolvidas no reparo de SSB induzido por radiação em células Swiss 3T6 proliferativas, quiescentes e estimuladas por mitógenos [7]. Utilizando a afidicolina, um inibidor específico das polimerases de DNA alfa e delta, e 2',3'-didesoxitimidina-5'-trifosfato para inibir a polimerase de DNA beta, eles descobriram que o reparo de SSB era mais sensível à afidicolina, independentemente do estado proliferativo. A afidicolina inibiu a recuperação do DNA com potência aproximadamente três vezes maior em células quiescentes e estimuladas por mitógeno do que em células em proliferação ativa, indicando que uma polimerase sensível à afidicolina — muito provavelmente a polimerase alfa do DNA — é a etapa limitante do reparo em células quiescentes.

No campo do metabolismo de nucleotídeos, Tatibana e colegas estudaram a estimulação mitogênica precoce do fluxo metabólico por meio do fosforibosilpirofosfato (PRPP) para a formação de nucleotídeos [8]. Trabalhando principalmente com células Swiss 3T3, eles demonstraram que o EGF associado à insulina aumentava o fluxo através do PRPP em cerca de duas vezes e que a entrada de magnésio externo era necessária para a resposta. Células Swiss 3T6 quiescentes foram examinadas juntamente com fibroblastos fetais humanos e apresentaram uma estimulação comparável da síntese de nucleotídeos após exposição ao soro, colocando as 3T6 diretamente na série experimental e ilustrando como a biossíntese de novo de purinas e pirimidinas é ativada como uma resposta precoce à estimulação mitogênica.

Regulação do ciclo celular e diferenciação

Um estudo marcante realizado por Kleuser e Adam comparou diretamente as células suíças 3T3 e 3T6 para investigar a relação entre o conteúdo de RNA ribossômico, o tamanho celular e a entrada no ciclo celular [9]. Suas descobertas revelaram uma distinção biológica fundamental entre as duas linhagens: as células 3T3 exigiam um nível mínimo de conteúdo de rRNA celular antes de reentrar no ciclo celular, enquanto as células 3T6 iniciavam a replicação do DNA sem um aumento substancial no rRNA. Essa diferença foi interpretada como evidência de que a transformação das células 3T6 envolvia um desacoplamento do ponto de verificação de tamanho que normalmente rege a entrada no ciclo celular, fornecendo uma compreensão mecanicista do fenótipo transformado dessa linhagem.

Thayer e colegas demonstraram que a transfecção do gene de determinação miogênica MyoD1 ativa a expressão do gene MyoD1 endógeno, indicando autorregulação positiva [10]. O sistema experimental principal foi a linhagem 10T1/2, mas o efeito sobre o mRNA endógeno de MyoD1 foi reproduzido nas células Swiss 3T6 — notavelmente, a única linhagem adicional entre várias linhagens de fibroblastos e adipoblastos testadas nas quais isso foi observado. Essa especificidade torna a 3T6 um fundo permissivo informativo para estudos de conversão miogênica. O mesmo trabalho mostrou que o MyoD1 e a miogenina participam de um ciclo de autorregulação positiva, uma contribuição mecanicista para a compreensão do comprometimento miogênico publicada na revista *Cell*.

Chin e Liem utilizaram células Swiss 3T6, em paralelo com células L tk⁻ de camundongo, como hospedeiras estáveis para transfecção, a fim de estudar a expressão das proteínas de neurofilamentos de rato NF-L e NF-M em um contexto celular não neuronal [11]. Os cDNAs de neurofilamentos foram expressos por promotores do SV40 e do vírus do sarcoma de Rous, enquanto um promotor precoce do SV40 controlava o marcador de seleção com neomicina. Clones resistentes ao G418 foram recuperados tanto com as construções de NF-L quanto com as de NF-M, mas apenas clones que expressavam NF-M detectável por imunofluorescência puderam ser estabelecidos; a imunoeletronmicroscopia mostrou que o NF-M se colocalizava com a vimentina nos mesmos filamentos intermediários. Separadamente, Gonzalez e colegas utilizaram fibroblastos de camundongo Swiss 3T6 para caracterizar duas vias distintas de sinalização mediadas por receptores de ATP que regulam o efluxo de cálcio e a permeabilização da membrana plasmática, demonstrando dessensibilização seletiva entre as vias, consistente com a existência de múltiplos purinoceptores nessas células [12].

Interações hospedeiro-patógeno

As células albinas 3T6-Swiss provaram ser um modelo in vitro produtivo para o estudo de patógenos bacterianos intracelulares, particularmente o Spiroplasma eriocheiris. Hou e colegas demonstraram que o S. eriocheiris era capaz de invadir células 3T6, formar corpos de inclusão e induzir vacuolização, conforme visualizado por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão [13]. A citometria de fluxo e os ensaios de MTT confirmaram que a infecção induzia apoptose e reduzia significativamente a viabilidade celular. Bactérias infecciosas foram detectadas já uma hora após a infecção e aumentaram acentuadamente às 12 horas. O perfil de expressão emparelhado de mRNA e microRNA de células 3T6 infectadas identificou 619 transcritos diferencialmente expressos e 22 miRNAs diferencialmente expressos após seis horas, convergindo para as vias de sinalização de adesão focal e MAPK.

Os mecanismos moleculares dessa interação foram analisados mais detalhadamente no mesmo modelo celular. Hou e colegas identificaram uma proteína semelhante a uma adesina (ALP) na membrana externa de S. eriocheiris e demonstraram que ela é necessária para a infecção de células 3T6-Swiss albino [14]. A triagem por dois híbridos em levedura, far-western blotting e experimentos de colocalização estabeleceram que a ALP se liga ao domínio EGF da proteína fibulina-7 de camundongo e que a ALP recombinante suprime a atividade da via do EGFR em células 3T6 por meio da competição com o EGF — um exemplo notável de uma proteína de superfície bacteriana explorando um eixo de fator de crescimento do hospedeiro. Em um estudo complementar, Zhu e colegas caracterizaram uma lisofosfolipase de S. eriocheiris, observando a capacidade do organismo de invadir e sobreviver dentro das células 3T6 de camundongo, e demonstraram, por meio de neutralização com anticorpos, que a enzima contribui para a virulência durante o estágio inicial da infecção [15]. Juntos, esses estudos estabelecem as células 3T6-Swiss albino como um modelo mamífero reproduzível para pesquisas sobre a infecção por Spiroplasma.

Avaliação de Biomateriais e Aplicações em Biossensores

O crescimento robusto e as características fibroblásticas das células 3T6-Swiss albino as tornaram um modelo útil para avaliar a biocompatibilidade de novos biomateriais. Rathinavel e colegas avaliaram nanoestruturas compostas eletrofiadas compostas por sílica mesoporosa (SBA-15), policaprolactona e curcumina para aplicações na cicatrização de feridas [16]. A migração, a proliferação e a biocompatibilidade celular foram avaliadas em células 3T6-Swiss albino por meio de ensaios de adesão celular e de células vivas/mortas, complementando testes antibacterianos e um modelo in vivo de ferida em ratos. O estudo destacou a utilidade prática das células 3T6-Swiss albino como plataforma de triagem para candidatos a biomateriais destinados à cicatrização de feridas.

Além dos testes de materiais, as células 3T6-Swiss albinas têm sido empregadas em pesquisas com biossensores baseados em células. Nicolini e colegas utilizaram um biossensor potenciométrico alternado (PAB) à base de silício — uma configuração de transdutor sensível ao pH e acionável por luz — para monitorar as taxas de acidificação extracelular em tempo real como indicador da toxicidade de medicamentos [17]. Juntamente com hepatócitos primários de rato e células de hepatoma HepG2 tratadas com mitoxantrona, os autores registraram alterações na taxa de acidificação de fibroblastos de camundongo 3T6 após o tratamento com o antimetabolito de DNA citarabina (Ara-C) e compararam as leituras do sensor com as obtidas por microscopia óptica convencional, o Vermelho Neutro e os ensaios com Azul de Tripano. A linhagem mostrou-se adequada para esses experimentos devido à sua atividade metabólica previsível e à facilidade de cultura em substratos do sensor. Coletivamente, essas aplicações demonstram que as células 3T6-Swiss albino ocupam um nicho útil na pesquisa translacional, fazendo a ponte entre a biologia celular e a ciência dos materiais.

Conclusão

As células albinas 3T6-Swiss (CVCL_0601) representam uma linhagem de fibroblastos de camundongo notavelmente versátil e historicamente significativa. Originalmente estabelecida a partir de embriões de camundongo suíço por Todaro e Green em 1963, sob um regime de transferência de três dias a 6 × 10⁵ células por placa, a linhagem acumulou uma extensa literatura abrangendo virologia, reparo de DNA, biologia do ciclo celular, diferenciação miogênica, sinalização de receptores, interações hospedeiro-patógeno e avaliação de biomateriais. Seu rápido tempo de duplicação, suscetibilidade à infecção viral produtiva e capacidade de resposta a fatores de crescimento e mitógenos tornam-na um sistema-modelo maleável e experimentalmente flexível. Seja para estudar a transcrição do poliomavírus, investigar o reparo de quebras na fita de DNA induzidas por radiação reguladas pelo EGF, avaliar a biocompatibilidade de novas estruturas de cicatrização de feridas ou avaliar a patogênese bacteriana intracelular, as células 3T6-Swiss albino oferecem uma plataforma experimental bem validada e reproduzível. Pesquisadores que desejarem incorporar essa linhagem celular em seus programas podem consultar as especificações completas do produto ou encomendar as células 3T6-Swiss albino diretamente no site cytion.com.

Principais publicações

1. Todaro GJ, Green H (1963) Estudos quantitativos do crescimento de células embrionárias de camundongo em cultura e seu desenvolvimento em linhagens estabelecidas. The Journal of Cell Biology. PMID: 13985244
2. Lung O, Candlish R, Nebroski M, et al. (2021) Sequenciamento de alto rendimento para autenticação de espécies e detecção de contaminação em 63 linhagens celulares. Scientific Reports. PMID: 34737324
3. Hyde-DeRuyscher R, Carmichael GG (1988) A transição entre as fases precoce e tardia do poliomavírus não é regulada no nível da iniciação da transcrição e está associada a alterações no processamento do RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. PMID: 2848251
4. Rhee E, Carmichael GG (1989) Eficiências de tradução de moléculas de mRNA tardias do poliomavírus que diferem nas sequências de seus exons líderes tardios não codificantes 5'. Journal of Virology. PMID: 2535746
5. Chang D, Haynes JI 2º, Brady JN, Consigli RA (1992) Identificação de uma sequência de localização nuclear na proteína VP2 da cápside do poliomavírus. Virology. PMID: 1333132
6. Bildin VN, Seregina TB, Zhestyanikov VD (1990) Efeito do fator de crescimento epidérmico (EGF) e da insulina na cinética do reparo de lesões no DNA induzidas por radiação. Acta Biologica Hungarica. PMID: 2094129
7. Bil'din VN, Seregina TB, Zhestianikov VD (1992) A regulação do processo de reparo do DNA em células de mamíferos. IV. O papel das polimerases de DNA na regulação, pelo fator de crescimento epidérmico, do reparo de quebras de DNA de fita simples induzidas por radiação ionizante em células de camundongo Swiss 3T6. Tsitologiia (em russo; resumo em inglês). PMID: 1295156
8. Tatibana M, Ishijima S, Kita K, et al. (1989) Estimulação mitogênica precoce do fluxo metabólico do fosforibosilpirofosfato para a formação de nucleotídeos em células Swiss 3T3 e necessidade de magnésio externo para a resposta. Advances in Enzyme Regulation. PMID: 2483026
9. Kleuser B, Adam G (1985) Inter-relação entre o conteúdo de rRNA celular e a regulação do ciclo celular de linhagens celulares normais e transformadas de camundongo. Cell Biology International Reports. PMID: 3905022
10. Thayer MJ, Tapscott SJ, Davis RL, Wright WE, Lassar AB, Weintraub H (1989) Autorregulação positiva do gene de determinação miogênica MyoD1. Cell. PMID: 2546677
11. Chin SS, Liem RK (1989) Expressão das proteínas neurofilamentares de rato NF-L e NF-M em células não neuronais transfectadas. European Journal of Cell Biology. PMID: 2516804
12. Gonzalez FA, Bonapace E, Belzer I, Friedberg I, Heppel LA (1989) É possível distinguir dois receptores distintos para o ATP em fibroblastos de camundongo Swiss 3T6 com base em sua dessensibilização. Biochemical and Biophysical Research Communications. PMID: 2818584
13. Hou L, Gu W, Zhu H, et al. (2017) O Spiroplasma eriocheiris induz a apoptose de células albinas 3T6-Swiss de camundongo, associada ao mecanismo de infecção. Molecular Immunology. PMID: 28889064
14. Hou L, Liu Y, Gao Q, et al. (2017) A proteína semelhante à adesina (ALP) do Spiroplasma eriocheiris interage com proteínas do domínio do fator de crescimento epidérmico (EGF) para facilitar a infecção. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. PMID: 28184355
15. Zhu H, Liu P, Du J, et al. (2017) Identificação da proteína lisofosfolipase do Spiroplasma eriocheiris e verificação de sua função. Microbiology (Reading). PMID: 27926815
16. Rathinavel S, Korrapati PS, Kalaiselvi P, Dharmalingam S (2021) Nanofibra de PCL/curcumina incorporada com sílica mesoporosa para aplicação na cicatrização de feridas. European Journal of Pharmaceutical Sciences. PMID: 34571179
17. Nicolini C, Lanzi M, Accossato P, et al. (1995) Um biossensor à base de silício para testes de toxicidade em tempo real em células hepáticas normais versus cancerosas. Biosensors and Bioelectronics. PMID: 7576440