Introdução

O Células 3T6-Swiss albinas, também conhecida como Swiss 3T6, NIH 3T6, 3T6 e GM05862, representa uma das linhas celulares de fibroblastos de ratinho imortalizadas espontaneamente mais duradouras na investigação biomédica. Criada em 1963 por Todaro e Green a partir de embriões de ratinho suíço desagregados, esta linha foi uma das primeiras a demonstrar que as células embrionárias primárias de ratinho podiam sofrer imortalização espontânea em condições de passagem definidas [1]. Ao longo das décadas seguintes, os investigadores utilizaram as células albinas 3T6-Swiss numa gama notavelmente ampla de disciplinas, incluindo virologia, reparação do ADN, metabolismo dos nucleótidos, biologia dos recetores e avaliação de biomateriais. O rápido tempo de duplicação da linha celular, as suas características de crescimento robustas e a morfologia fibroblástica tornam-na um modelo experimentalmente maleável. A sua capacidade de resposta bem caracterizada a fatores de crescimento e mitógenos também a tornou uma ferramenta preferida para o estudo da transdução de sinais e da regulação do ciclo celular em contextos de fibroblastos não transformados em comparação com os espontaneamente transformados.

Pontos-chave

• A 3T6-Swiss albino é uma linha celular de fibroblastos de rato imortalizada espontaneamente, estabelecida em 1963 a partir de embriões de rato suíço por Todaro e Green.
• A linha celular tem o número de acesso CVCL_0601 no banco de dados Cellosaurus e apresenta um tempo de duplicação excepcionalmente rápido, de aproximadamente 15 horas.
• A designação «3T6» indica o regime de cultura utilizado para a sua obtenção: transferência a cada 3 dias com um inóculo de 6 × 10⁵ células por placa.
• Tem sido amplamente utilizado em estudos de virologia, nomeadamente na investigação sobre a transcrição, a replicação e as proteínas da cápside dos poliomavírus.
• Esta linha serve como um modelo robusto para a investigação dos mecanismos de reparação do ADN, da sinalização dos fatores de crescimento e da biossíntese de nucleótidos.
• As células albinas suíças 3T6 são suscetíveis a infeções bacterianas intracelulares, o que as torna úteis para estudos sobre a interação hospedeiro-patógeno.
• Esta linha foi validada para ensaios de biocompatibilidade e citotoxicidade no âmbito da investigação sobre biomateriais e cicatrização de feridas.

O que é o 3T6-Swiss albino?

A linha 3T6-Swiss albino (CVCL_0601) foi obtida a partir de tecido embrionário inteiro de ratos Swiss albino; o Cellosaurus regista o sexo da linha como masculino. As culturas iniciais foram preparadas através da trituração de embriões de ratinho suíço com idades compreendidas entre os 17 e os 19 dias, agrupados em conjunto, pelo que a linhagem não remonta a um único animal doador identificado [1]. A linha celular foi estabelecida através do protocolo 3T, que constituiu um marco histórico, concebido por Todaro e Green, no qual células embrionárias primárias de ratinho foram submetidas a passagens sucessivas a intervalos fixos e com densidades de inoculação definidas, até ocorrer a imortalização espontânea. A nomenclatura reflete diretamente esse regime: «3T» significa transferência em intervalos de três dias, e o segundo número indica o inóculo em unidades de 10⁵ células por placa. Assim, a linha 3T6 foi mantida a 6 × 10⁵ células por placa, juntamente com as linhas irmãs 3T3 (3 × 10⁵) e 3T12 (12 × 10⁵) descritos no mesmo estudo [1].

As condições de cultura utilizadas durante o estabelecimento determinaram o fenótipo resultante. Enquanto as células 3T3 foram deliberadamente mantidas em baixa densidade e nunca se lhes permitiu atingir a confluência — produzindo uma linha que apresenta uma inibição por contacto extremamente acentuada —, as linhas mantidas em densidades mais elevadas perderam progressivamente a inibição por contacto, formaram multicamadas e atingiram densidades de saturação muito mais elevadas [1]. Os bancos de células descrevem, portanto, a linha 3T6 como não inibida pelo contacto, em contraste explícito com a linha 3T3. Tal como todas as linhas de ratinho estabelecidas nesse estudo, a 3T6 também passou de um cariótipo diplóide para um heteroplóide durante o seu estabelecimento, situando-se na gama hipotetraplóide; os repositórios relatam um cariótipo instável com uma linha-mãe de 78–81 cromossomas. A linha produz colagénio e ácido hialurónico, mantendo certas características do tecido conjuntivo que refletem a sua origem fibroblástica. A identidade da espécie foi confirmada por sequenciação de alto rendimento direcionada para o gene da subunidade 1 da citocromo c oxidase (COX1), proporcionando uma autenticação molecular independente da origem murina [2].

Informações sobre cultura celular

Vantagens das células albinas 3T6-Swiss

Uma das vantagens mais práticas das células 3T6-Swiss albinas é a sua rápida taxa de proliferação. Todaro e Green documentaram como o tempo de geração da linha 3T6 emergente diminuiu de 29 horas para 15 horas ao longo de oito transferências sucessivas, após a população se ter tornado totalmente heteroplóide, tendo-se registado valores inferiores a 14 horas na mesma linha [1]. Por conseguinte, os bancos de células indicam um tempo de duplicação de aproximadamente 15 horas. Isto permite fluxos de trabalho experimentais de alto rendimento e reduz o tempo necessário para gerar um número suficiente de células para os ensaios, enquanto o padrão de crescimento em monocamada aderente facilita a observação e a manipulação ao microscópio.

A ampla maleabilidade experimental das células albinas 3T6-Swiss constitui uma segunda grande vantagem. Esta linha permite a transfecção estável e transitória com uma variedade de construções de expressão, tem sido utilizada para a propagação produtiva de poliomavírus e responde de forma fiável a estímulos extracelulares, tais como fatores de crescimento e agonistas purinérgicos. Esta versatilidade significa que uma única linha celular pode satisfazer múltiplas necessidades experimentais num mesmo laboratório, reduzindo o esforço associado à manutenção de inúmeros stocks celulares distintos. Além disso, a linha demonstrou a sua utilidade num espectro diversificado de disciplinas — desde a virologia molecular até aos ensaios de biomateriais —, sublinhando a sua ampla aplicabilidade.

Limitações das células 3T6-Swiss albinas

Sendo uma linha imortalizada espontaneamente que perdeu a inibição por contacto durante o estabelecimento, as células albinas 3T6-Swiss atingem densidades de saturação muito superiores às dos fibroblastos normais e não apresentam a paragem de crescimento dependente da densidade característica das culturas com inibição por contacto [1]. Por conseguinte, não reproduzem as respostas de inibição de contacto observadas em linhas como a 3T3, o que pode constituir uma consideração crítica na conceção de experiências destinadas a recriar a fisiologia dos tecidos normais. Os investigadores que estudam a supressão tumoral, o controlo do crescimento dependente da ancoragem ou as respostas normais de cicatrização de feridas devem ter cuidado ao interpretar os resultados desta linha. O cariótipo constitui uma limitação relacionada: a 3T6 é heteroplóide e não diploide, com um complemento cromossómico instável na gama hipotetraplóide, pelo que não constitui uma base adequada para trabalhos que exijam um genoma euploide.

Uma limitação adicional prende-se com a natureza murina, embrionária e fibroblástica do modelo. Os resultados obtidos em células 3T6-Swiss albinas podem não ser diretamente aplicáveis à biologia celular humana ou a tipos de células diferenciadas. Tal como acontece com todas as linhas celulares contínuas, a deriva genómica ao longo de um número elevado de passagens pode introduzir variabilidade fenotípica. Recomenda-se, portanto, a autenticação regular para confirmar a identidade da espécie e detetar potenciais eventos de contaminação cruzada ao longo do tempo. Note-se que a análise de repetições em tandem curtas (STR), o padrão de referência para as linhas humanas, não é aplicável neste caso; para as linhas celulares não humanas, o código de barras de ADN do gene COX1 é a abordagem estabelecida, e a linha 3T6 foi autenticada precisamente por esse método [2].

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Aplicações

Virologia e expressão génica viral

As células 3T6-Swiss albino têm servido como um sistema hospedeiro produtivo para a investigação sobre o poliomavírus há várias décadas. Hyde-DeRuyscher e Carmichael utilizaram células NIH 3T6 para realizar ensaios detalhados de «nuclear run-on» e analisar a regulação temporal da expressão génica do poliomavírus durante a infeção produtiva [3]. O seu trabalho demonstrou que a transição da fase precoce para a fase tardia do poliomavírus não era regulada ao nível do início da transcrição. Em vez disso, essa transição estava associada a alterações no processamento do ARN, uma descoberta que moldou fundamentalmente a compreensão da regulação génica viral nos fibroblastos de ratinho.

Rhee e Carmichael utilizaram o sistema de infeção NIH 3T6 para investigar as eficiências de tradução dos ARNm tardios do poliomavírus. Eles coinfetaram células com duas estirpes virais que diferiam apenas nas suas sequências 5' não codificantes do exão líder tardio e isolaram polissomas em momentos tardios da infeção [4]. As suas experiências de caracterização de polissomas demonstraram que a sequência do líder tardio não influenciava a eficiência de tradução, proporcionando uma importante compreensão mecanicista da utilização do ARNm viral.

Num estudo complementar, Chang e colegas identificaram um sinal de localização nuclear (NLS) na região C-terminal da proteína VP2 da cápside menor do poliomavírus, utilizando duas estratégias convergentes [5]. Na abordagem genética «subtrativa», construções da VP2 de comprimento total e truncadas foram transfectadas em células COS-7, demonstrando que a remoção dos resíduos Glu307–Leu318 confinava a VP2 ao citoplasma. A abordagem bioquímica «aditiva» baseou-se em células NIH 3T6: um péptido sintético correspondente a essa sequência foi reticulado com albumina sérica bovina e imunoglobulina G, marcado com fluorescência e microinjetado no citoplasma das células 3T6, onde ambos os conjugados se acumularam no núcleo, ao passo que as proteínas transportadoras não conjugadas não o fizeram. A adequação das células 3T6 para a microinjeção citoplasmática foi, assim, fundamental para estabelecer o NLS.

Reparação do ADN e sinalização dos fatores de crescimento

As células 3T6-Swiss albinas têm sido amplamente utilizadas para investigar a reparação de quebras na cadeia de ADN induzidas por radiação ionizante e o papel dos fatores de crescimento na modulação deste processo. Bildin, Seregina e Zhestyanikov examinaram a cinética da reparação de quebras de cadeia simples (SSB) e de quebras de cadeia dupla (DSB) em células 3T6 suíças expostas a radiação ionizante em doses de 5–10 Gy [6]. Utilizaram eluição neutra e alcalina, juntamente com centrifugação em gradiente alcalino de sacarose, para quantificar as quebras de cadeia. As suas descobertas revelaram que a privação de soro reduziu drasticamente as taxas de reparação, enquanto a reestimulação com o fator de crescimento epidérmico (EGF) e insulina as restaurou parcialmente, estabelecendo uma ligação direta entre a sinalização mitogénica e a capacidade de reparação de danos no ADN.

Um estudo subsequente realizado por Bil'din, Seregina e Zhestianikov aprofundou este trabalho, caracterizando as polimerases de ADN específicas envolvidas na reparação de SSB induzida por radiação em células Swiss 3T6 em proliferação, em estado de quiescência e estimuladas por mitogénicos [7]. Utilizando a afidicolina, um inibidor específico das polimerases de ADN alfa e delta, e 2',3'-didesoxitimidina-5'-trifosfato para inibir a polimerase de ADN beta, descobriram que a reparação de SSB era mais sensível à afidicolina, independentemente do estado proliferativo. A afidicolina inibiu a recuperação do ADN de forma aproximadamente três vezes mais potente em células quiescentes e estimuladas por mitógenos do que em células em proliferação ativa, apontando para uma polimerase sensível à afidicolina — muito provavelmente a polimerase alfa do ADN — como a etapa limitante do reparo em células quiescentes.

No domínio do metabolismo dos nucleótidos, Tatibana e colegas estudaram a estimulação mitogénica precoce do fluxo metabólico através do fosforibosil pirofosfato (PRPP) para a formação de nucleótidos [8]. Trabalhando principalmente com células Swiss 3T3, demonstraram que o EGF, em combinação com a insulina, aumentava o fluxo através do PRPP cerca de duas vezes e que a entrada de magnésio externo era necessária para a resposta. As células Swiss 3T6 quiescentes foram analisadas em conjunto com fibroblastos fetais humanos e revelaram uma estimulação comparável da síntese de nucleótidos após a exposição ao soro, colocando as células 3T6 diretamente na série experimental e ilustrando como a biossíntese de novo de purinas e pirimidinas é ativada como uma resposta precoce à estimulação mitogénica.

Regulação do ciclo celular e diferenciação

Um estudo marcante de Kleuser e Adam comparou diretamente as células suíças 3T3 e 3T6 para investigar a relação entre o conteúdo de ARN ribossómico, o tamanho celular e a entrada no ciclo celular [9]. As suas descobertas revelaram uma distinção biológica fundamental entre as duas linhas: as células 3T3 necessitavam de um nível limiar de conteúdo de rRNA celular antes de reentrarem no ciclo celular, enquanto as células 3T6 iniciavam a replicação do ADN sem um aumento substancial do rRNA. Esta diferença foi interpretada como prova de que a transformação das células 3T6 envolvia um desacoplamento do ponto de controlo do tamanho que normalmente rege a entrada no ciclo celular, proporcionando uma compreensão mecanicista do fenótipo transformado desta linha.

Thayer e colegas demonstraram que a transfecção do gene de determinação miogénica MyoD1 ativa a expressão do gene MyoD1 endógeno, indicando uma autorregulação positiva [10]. O sistema experimental principal foi a linha 10T1/2, mas o efeito sobre o ARNm endógeno de MyoD1 foi reproduzido nas células Swiss 3T6 — notavelmente a única linha adicional, entre várias linhas de fibroblastos e adipoblastos testadas, na qual tal efeito foi observado. Essa especificidade torna a 3T6 um fundo permissivo informativo para estudos de conversão miogénica. O mesmo trabalho demonstrou que o MyoD1 e a miogenina participam num ciclo de autorregulação positiva, uma contribuição mecanicista para a compreensão do compromisso miogénico publicada na revista *Cell*.

Chin e Liem utilizaram células Swiss 3T6, em paralelo com células L ^tk− de ratinho, como hospedeiro de transfecção estável para estudar a expressão das proteínas de neurofilamentos de rato NF-L e NF-M num contexto celular não-neuronal [11]. Os cDNAs dos neurofilamentos foram expressos por promotores do SV40 e do vírus do sarcoma de Rous, enquanto um promotor precoce do SV40 controlava o marcador de seleção com neomicina. Foram recuperados clones resistentes ao G418 com ambas as construções NF-L e NF-M, mas apenas foi possível estabelecer clones que expressavam NF-M detetável por imunofluorescência; a imunomicroscopia eletrónica revelou que a NF-M se colocalizava com a vimentina nos mesmos filamentos intermédios. Por outro lado, Gonzalez e colegas utilizaram fibroblastos de ratinho Swiss 3T6 para caracterizar duas vias de sinalização distintas, mediadas por recetores de ATP, que regulam o efluxo de cálcio e a permeabilização da membrana plasmática, demonstrando uma dessensibilização seletiva entre as vias, consistente com a existência de múltiplos purinoceptores nestas células [12].

Interações hospedeiro-patógeno

As células albinas 3T6-Swiss revelaram-se um modelo in vitro produtivo para o estudo de patógenos bacterianos intracelulares, particularmente o Spiroplasma eriocheiris. Hou e colegas demonstraram que o S. eriocheiris conseguia invadir as células 3T6, formar corpos de inclusão e induzir vacuolização, conforme visualizado por imunofluorescência e microscopia eletrónica de transmissão [13]. A citometria de fluxo e os ensaios MTT confirmaram que a infeção induzia apoptose e reduzia significativamente a viabilidade celular. As bactérias infecciosas eram detetáveis já uma hora após a infeção e aumentaram acentuadamente às 12 horas. A análise emparelhada dos perfis de expressão de ARNm e microARN das células 3T6 infetadas identificou 619 transcritos diferencialmente expressos e 22 microARNs diferencialmente expressos após seis horas, convergindo para as vias de sinalização da adesão focal e da MAPK.

Os mecanismos moleculares desta interação foram analisados mais aprofundadamente no mesmo modelo celular. Hou e colegas identificaram uma proteína semelhante a uma adesina (ALP) na membrana externa de S. eriocheiris e demonstraram que esta é necessária para a infeção de células 3T6-Swiss albino [14]. O rastreio por duplo híbrido em levedura, o far-western blotting e experiências de colocalização estabeleceram que a ALP se liga ao domínio EGF da proteína fibulina-7 do rato e que a ALP recombinante suprime a atividade da via do EGFR nas células 3T6 através da competição com o EGF — um exemplo notável de uma proteína da superfície bacteriana que explora um eixo de fatores de crescimento do hospedeiro. Num estudo complementar, Zhu e colegas caracterizaram uma lisofosfolipase de S. eriocheiris, observando a capacidade do organismo para invadir e sobreviver no interior de células 3T6 de ratinho, e demonstraram, por neutralização com anticorpos, que a enzima contribui para a virulência durante a fase inicial da infeção [15]. Em conjunto, estes estudos estabelecem as células 3T6-Swiss albino como um modelo mamífero reprodutível para a investigação da infeção por Spiroplasma.

Avaliação de Biomateriais e Aplicações em Biossensores

O crescimento robusto e as características fibroblásticas das células 3T6-Swiss albino tornaram-nas um modelo útil para avaliar a biocompatibilidade de novos biomateriais. Rathinavel e colegas avaliaram nanoestruturas compostas obtidas por eletrofiação, compostas por sílica mesoporosa (SBA-15), policaprolactona e curcumina, para aplicações na cicatrização de feridas [16]. A migração celular, a proliferação e a biocompatibilidade foram avaliadas em células 3T6-Swiss utilizando ensaios de adesão celular e de células vivas/mortas, complementando testes antibacterianos e um modelo de ferida in vivo em ratos. O estudo destacou a utilidade prática das células 3T6-Swiss albino como plataforma de triagem para biomateriais candidatos à cicatrização de feridas.

Para além dos ensaios de materiais, as células 3T6-Swiss albinas têm sido utilizadas na investigação de biossensores baseados em células. Nicolini e colegas utilizaram um biossensor potenciométrico alternado (PAB) à base de silício — uma configuração de transdutor sensível ao pH e endereçável por luz — para monitorizar as taxas de acidificação extracelular em tempo real como indicador da toxicidade de um fármaco [17]. A par de hepatócitos primários de rato e células de hepatoma HepG2 tratadas com mitoxantrona, os autores registaram alterações na taxa de acidificação dos fibroblastos de ratinho 3T6 após tratamento com o antimetabolito do ADN citarabina (Ara-C) e compararam as leituras do sensor com as obtidas por microscopia ótica convencional, o Vermelho Neutro e os ensaios com Azul de Tripano. Esta linha revelou-se adequada para estas experiências devido à sua atividade metabólica previsível e à facilidade de cultura em substratos do sensor. Em conjunto, estas aplicações demonstram que as células 3T6-Swiss albino ocupam um nicho útil na investigação translacional, fazendo a ponte entre a biologia celular e a ciência dos materiais.

Conclusão

As células albinas 3T6-Swiss (CVCL_0601) representam uma linha celular de fibroblastos de rato notavelmente versátil e historicamente significativa. Originalmente estabelecida a partir de embriões de ratinho suíço por Todaro e Green em 1963, sob um regime de transferência de três dias a 6 × 10⁵ células por placa, a linha acumulou uma extensa literatura que abrange virologia, reparação do ADN, biologia do ciclo celular, diferenciação miogénica, sinalização de recetores, interações hospedeiro-patógeno e avaliação de biomateriais. O seu rápido tempo de duplicação, a suscetibilidade a infeções virais produtivas e a capacidade de resposta a fatores de crescimento e mitógenos tornam-na um sistema modelo maleável e experimentalmente flexível. Quer o objetivo seja estudar a transcrição do poliomavírus, investigar a reparação de quebras na cadeia de ADN induzidas por radiação e reguladas pelo EGF, avaliar a biocompatibilidade de novos suportes para a cicatrização de feridas ou avaliar a patogénese bacteriana intracelular, as células 3T6-Swiss albino oferecem uma plataforma experimental bem validada e reprodutível. Os investigadores que pretendam incorporar esta linha celular nos seus programas podem consultar as especificações completas do produto ou encomendar as células 3T6-Swiss albino diretamente em cytion.com.

Publicações principais

1. Todaro GJ, Green H (1963) Estudos quantitativos do crescimento de células embrionárias de ratinho em cultura e do seu desenvolvimento em linhas estabelecidas. The Journal of Cell Biology. PMID: 13985244
2. Lung O, Candlish R, Nebroski M, et al. (2021) Sequenciação de alto rendimento para autenticação de espécies e deteção de contaminação em 63 linhas celulares. Scientific Reports. PMID: 34737324
3. Hyde-DeRuyscher R, Carmichael GG (1988) A transição entre as fases precoce e tardia do poliomavírus não é regulada ao nível do início da transcrição e está associada a alterações no processamento do ARN. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. PMID: 2848251
4. Rhee E, Carmichael GG (1989) Eficiências de tradução de moléculas de ARNm tardias do poliomavírus que diferem nas sequências dos seus exões líderes tardios não codificantes 5'. Journal of Virology. PMID: 2535746
5. Chang D, Haynes JI 2.º, Brady JN, Consigli RA (1992) Identificação de uma sequência de localização nuclear na proteína VP2 da cápside do poliomavírus. Virology. PMID: 1333132
6. Bildin VN, Seregina TB, Zhestyanikov VD (1990) Efeito do fator de crescimento epidérmico (EGF) e da insulina na cinética da reparação de lesões no ADN induzidas por radiação. Acta Biologica Hungarica. PMID: 2094129
7. Bil'din VN, Seregina TB, Zhestianikov VD (1992) A regulação do processo de reparação do ADN em células de mamíferos. IV. O papel das polimerases de ADN na regulação, pelo fator de crescimento epidérmico, do reparo de quebras de ADN de cadeia simples induzidas por radiação ionizante em células de ratinho Swiss 3T6. Tsitologiia (em russo; resumo em inglês). PMID: 1295156
8. Tatibana M, Ishijima S, Kita K, et al. (1989) Estimulação mitogénica precoce do fluxo metabólico através do fosforibosilpirofosfato para a formação de nucleótidos em células Swiss 3T3 e necessidade de magnésio externo para a resposta. Advances in Enzyme Regulation. PMID: 2483026
9. Kleuser B, Adam G (1985) Inter-relação entre o conteúdo de rRNA celular e a regulação do ciclo celular de linhas celulares normais e transformadas de ratinho. Cell Biology International Reports. PMID: 3905022
10. Thayer MJ, Tapscott SJ, Davis RL, Wright WE, Lassar AB, Weintraub H (1989) Autorregulação positiva do gene de determinação miogénica MyoD1. Cell. PMID: 2546677
11. Chin SS, Liem RK (1989) Expressão das proteínas neurofilamentares de rato NF-L e NF-M em células não neuronais transfectadas. European Journal of Cell Biology. PMID: 2516804
12. Gonzalez FA, Bonapace E, Belzer I, Friedberg I, Heppel LA (1989) É possível distinguir dois recetores distintos para o ATP em fibroblastos de ratinho Swiss 3T6 com base na sua dessensibilização. Biochemical and Biophysical Research Communications. PMID: 2818584
13. Hou L, Gu W, Zhu H, et al. (2017) O Spiroplasma eriocheiris induz a apoptose das células albinas 3T6-Swiss de ratinho, associada ao mecanismo de infeção. Molecular Immunology. PMID: 28889064
14. Hou L, Liu Y, Gao Q, et al. (2017) A proteína semelhante à adesina (ALP) do Spiroplasma eriocheiris interage com proteínas do domínio do fator de crescimento epidérmico (EGF) para facilitar a infeção. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. PMID: 28184355
15. Zhu H, Liu P, Du J, et al. (2017) Identificação da proteína lisofosfolipase do Spiroplasma eriocheiris e verificação da sua função. Microbiologia (Reading). PMID: 27926815
16. Rathinavel S, Korrapati PS, Kalaiselvi P, Dharmalingam S (2021) Nanofibra de PCL/curcumina incorporando sílica mesoporosa para aplicação na cicatrização de feridas. European Journal of Pharmaceutical Sciences. PMID: 34571179
17. Nicolini C, Lanzi M, Accossato P, et al. (1995) Um biossensor à base de silício para testes de toxicidade em tempo real em células hepáticas normais versus cancerosas. Biosensors and Bioelectronics. PMID: 7576440